[发明专利]一种测定配方乳粉中酪蛋白含量的双曲线法

权利要求书

1.一种测定配方乳粉中酪蛋白含量的双曲线法，其特征是：该方法包括如下步骤：首先是将被测样品经6mol/L盐酸于110℃水解22小时，水解溶液定容50mL后过滤，样品滤液和标准品溶液同时用衍生剂衍生，衍生物经高效液相色谱仪或超高效液相色谱仪分离、紫外检测器检测，测定出缬氨酸、丙氨酸、脯氨酸的含量，样品中酪蛋白含量与其所含的两种氨基酸含量比值存在二次函数的曲线关系，用不同含量的酪蛋白值与其所含的缬氨酸、丙氨酸、脯氨酸中两种氨基酸比值制作两个定量曲线方程，将被测样品中测得的相应氨基酸比值分别带入相应的曲线方程，计算出两个酪蛋白含量值，取平均值为测定结果；

（1）试样的制备

A、氨基酸试样制备：称取适量样品，其中蛋白质含量为10.0～30.0mg，置于带密封垫螺纹盖水解管中，向水解管内加45℃～50℃的温水6mL，轻轻震荡溶解样品，再加入浓盐酸6mL，轻震混匀，充入氮气1min后，拧紧螺丝盖，将水解管放在110℃±1℃的恒温干燥箱内水解22 h后取出冷却至室温；

将水解液用超纯水转移并定容至50 mL容量瓶中，残液洗三次，洗液合并后定容，混匀，滤纸过滤，吸取滤液1 mL放入指型瓶中，在60 ℃±2 ℃氮吹仪上浓缩至干或在低于50 ℃下减压蒸馏至干，残留物用1 mL超纯水溶解，即为试样溶液；

B、游离氨基酸试样制备：准确称取混合均匀的样品约2.5 g，精确至0.0001 g放入100mL锥形瓶中，加入约25 mL45 ℃～50 ℃温水溶解，降至室温后用盐酸溶液调节样品溶液的pH值至1.7±0.1，放置约1 min，再用氢氧化钠溶液调节样品溶液的pH值至4.5±0.1，超声振荡约10 min，用水转移并定容至50 mL容量瓶中混匀，滤纸过滤后经0.22 μm滤膜过滤，滤液即为试样溶液；

（2）曲线的制作

A、氨基酸标准曲线制作：将标准工作液衍生液注入到超高效液相色谱仪或高校液相色谱仪中，得到氨基酸标准工作液的峰面积，以标准工作液的峰面积为纵坐标，以标准工作液浓度μmol/mL为横坐标绘制标准曲线，该曲线用于计算各氨基酸浓度和含量，其中含量以每100克蛋白质中氨基酸所含克数表示；

B、样品定量计算的双曲线制作：以配制的不同酪蛋白含量为纵坐标，以上机测定后得到的缬氨酸/丙氨酸、缬氨酸/脯氨酸或其比值的倒数为横坐标，分别制定两个定量计算曲线，即双曲线，得到两个曲线方程，要求相关系数平方值≥0.9980；

（3）样品溶液的测定

将样品待测液注入到超高效液相色谱仪或高效液相色谱仪中得到峰面积，根据氨基酸标准曲线得到样品待测液中所需氨基酸的浓度μmol/mL，并可计算其含量及所需氨基酸比值；

（4）总蛋白的测定

样品中总蛋白的测定，在催化加热条件下使蛋白质分解，产生的氨与硫酸结合生成硫酸铵，碱化蒸馏时氨游离被硼酸吸收，用硫酸或盐酸滴定，根据酸的消耗体积乘以换算系数计算，即为蛋白质含量；

（5）氨基酸的计算

样品中各氨基酸占乳蛋白的含量按下列公式计算：

其中：

X——样品中氨基酸的含量，单位为克每百克蛋白质；

X1——样品中总氨基酸的含量，单位为克每百克蛋白质；

X2——样品中游离氨基酸的含量，单位为克每百克蛋白质；

C1——从标准曲线中获得试样总氨基酸测定液的浓度,单位为微摩每毫升μmol/mL；

C2——从标准曲线中获得游离氨基酸测定液的浓度，单位为微摩每毫升μmol/mL；

m1——称取的测定水解氨基酸样品的质量，单位为克；

m2——称取的测定游离氨基酸的样品的质量，单位为克；

MAA——各氨基酸的摩尔质量，单位为克每摩尔g/mol；

V1——测定水解氨基酸样品的体积，单位为毫升；

V2——测定游离氨基酸样品的体积，单位为毫升；

n1——测定水解氨基酸样品的稀释倍数；

n2——测定游离氨基酸样品的稀释倍数；

P——乳清蛋白含量，单位为克每百克；

Pz——总蛋白含量，单位为克每百克；

PF——乳酪蛋白含量，单位为克每百克；

（6）酪蛋白含量计算

由实验得到被测样品相应的氨基酸含量比值分别代入各自双曲线方程，得到两个酪蛋白含量，取平均值为测定结果，保留至小数点后一位，如需要计算乳清蛋白，则用100减去酪蛋白含量即得到乳清蛋白含量；

（7）精密度

双曲线测得的两个酪蛋白含量的绝对差值不得超过其算术平均值的5%。