[发明专利]II型草鱼呼肠孤病毒VP4-NS38融合蛋白基因、表达载体、菌株及其应用

说明书

本发明公开了一种II型草鱼呼肠孤病毒VP4‑NS38融合蛋白基因、表达载体、菌株及其应用。本发明通过融合PCR的方式将能够引起草鱼产生不同方式免疫应答反应的VP4和NS38蛋白以柔性linker连接，构建能够在枯草芽孢杆菌芽孢体中融合表达GCRVVP4‑NS38蛋白的重组芽孢杆菌。以该重组芽孢杆菌口服免疫草鱼能够刺激鱼体产生具有中和活性的黏膜抗体和血清抗体，而且能够引起草鱼产生体液免疫反应，也能够引起草鱼产生细胞免疫反应；同时还能够减少草鱼在病毒感染过程中的炎症反应。具有很好的安全性，对草鱼的生长不产生显著影响，也不会对草鱼的组织器官造成病理损害，可以应用在草鱼出血病口服疫苗的研究中。

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及II型草鱼呼肠孤病毒VP4-NS38融合蛋白基因、载体、菌株及其应用。

背景技术

草鱼是我国最主要的淡水养殖鱼类，据统计仅2017年我国养殖草鱼产量高达534.56万吨，但是由于草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus,GCRV)导致的草鱼出血病可引起患病草鱼鱼种各器官、组织不同程度的充血、出血症状，严重可导致患鱼死亡，致死率高达85％。目前草鱼出血病在我国湖北、湖南、广东、广西、江苏、浙江、安徽、福建、上海、四川等草鱼主养地区广泛流行，具有流行范围广、致死率高的特点，为我国渔业生产带来了巨大的经济损失。目前，对于草鱼出血病的防治，还没有特异有效的治疗药物和方法，最为有效的办法仍然是疫苗免疫预防。草鱼出血病土法疫苗和商品化的细胞灭活疫苗与细胞弱毒疫苗的应用，对减少草鱼出血病的发生起到了一定的效果。然而草鱼出血病灭活疫苗和弱毒活疫苗都需要通过肌肉注射途径免疫接种，操作复杂限制了草鱼出血病疫苗在生产上的推广和应用。

GCRV病毒粒子呈正二十面体，直径65～72nm，核心直径约为50nm，无囊膜，具有双层衣壳。成熟的GCRV病毒粒子主要由蛋白质和核酸组成，还含有少量的糖类，以糖蛋白形式存在，不含脂类。研究表明以GCRV具有中和活性保护性抗原制备的亚单位疫苗能够很好的诱导机体产生特异性免疫保护。方勤，郝贵杰等人研究发现GCRV外衣壳蛋白VP5和VP7的特异性抗体具有中和活性。方勤等制备GCRV-VP5蛋白的多克隆抗体能够封闭GCRV病毒体外感染，利用VP5的抗体中和GCRV病毒粒子上的VP5蛋白，结果发现病毒对宿主细胞的感染能力显著降低。徐诗英、刘林等在pFast Bac Dual中构建的GCRV VP6和VP7核酸疫苗，免疫注射草鱼，攻毒实验也表明其核酸疫苗对草鱼出血病有很好的免疫保护作用。

GCRV基因组包括11条分节段的双链RNA，编码7种结构蛋白和5种非结构蛋白。基于GCRV基因组编码蛋白的同源性比较和三维结构分析，GCRV与哺乳动物正呼肠孤病毒基因同源性较高，且结构相似。其中S6节段编码的外衣壳蛋白VP4与MRVμ1为同源蛋白，可能是GCRV外衣壳复合体的主要组成蛋白，在病毒入侵细胞过程中扮演重要角色。外衣壳蛋白通常为病毒诱导宿主产生适应性免疫的主要蛋白，前期研究结果表明GCRV VP4蛋白能够很好的中和活性，是制备草鱼出血病亚单位疫苗最的理想抗原表位。

鱼类口服接种疫苗不受时间、地点和鱼体大小的限制，适用于大群体接种，操作方便、省时、省力，便于大规模推广应用。但蛋白抗原在水体环境中稳定性差、利用率低，易被消化道内的蛋白酶降解，口服接种后免疫保护效果不佳。因此，能递呈抗原并维持抗原在动物消化道和环境中稳定性的载体是研制安全高效的鱼类口服疫苗的关键共性问题。近年来，尝试采用新型材料，如海藻酸盐、可生物降解高分子聚合材料(如聚DL-乳酸-聚乙二醇共聚物)包裹疫苗抗原，制备能在环境和动物胃肠道中保持抗原稳定性的口服微球疫苗。尽管口服微球疫苗免疫效果有所提高，但还有诸多尚待解决的问题。譬如，微球共聚物制备工艺中添加的有机金属催化剂(如三基铝化合物)和机溶剂(如二氯甲烷等)残留对接种动物和环境生物的毒副作用；在微球制备后期的冷冻干燥过程中，添加避免影响抗原活性的多种稳定剂仍存留其中。