[发明专利]人源诺如病毒GII.4型的特征性核酸鉴别引物组、试剂盒和检测方法

说明书

本发明公开了人源诺如病毒GII.4型的特征性核酸鉴别引物组、试剂盒和检测方法。其包括正向引物、反向引物和探针；所述的正向引物选自RF1或RF2；反向引物选自RR1‑RR4中的任一条。本发明靶向针对诺如病毒主要流行型GII.4基因型，10分钟即可完成检测，检测限可达到每个反应2.67×10¹copies，对GI型诺如病毒、星状病毒、札幌病毒、轮状病毒、肠病毒、腺病毒，以及GII.2、GII.3、GII.4、GII.6、GII.8、GII.17等其他型别诺如病毒均无扩增信号；本发明应用实际临床样本检测，结果显示与荧光定量RT‑PCR的契合度达到了88.90％。本发明建立的检测方法灵敏度高、特异性好、周期短，适用于现场实时检测，可广泛应用于医疗卫生、检验检疫等具有诺如病毒检测需求的领域。

技术领域

本发明属于微生物安全检测技术领域，具体涉及人源诺如病毒GII.4型的特征性核酸鉴别引物组、试剂盒和检测方法。

背景技术

据世界卫生组织(World Health Organization，WHO)最新统计，发达国家每年约30％的人口患食源性疾病，发展中国家情况更加严重；全球每年约有6亿食源性疾病病例，死亡人数高达42万，其中诺如病毒是造成全球急性胃肠炎的最常见食源性病原，每年对人群造成巨大健康威胁与社会经济损失。诺如病毒能够感染各年龄段人群，并且没有明显的季节性，一年四季均可感染，婴幼儿、老人更是发病的高危人群。

诺如病毒在世界范围内流行甚广，2020年2月美国路易斯安那州一所赌场诺如病毒爆发导致至少200人感染，我国也是诺如病毒流行的主要国家之一，在多数省市被发现是引起急性胃肠炎的主要病原之一，对公共卫生安全造成极大的隐患。广东地区是我国的诺如病毒主要流行地区，早在2013年广州大学城暴发数百人诺如病毒感染，最近一次为2020年2月广东梅州暴发大规模诺如病毒感染，发病近400例。自2014年以来，诺如病毒已上升为首位散发性腹泻病原，年感染率超过20％。因此，我国加强食源性诺如病毒防控研究已迫在眉睫。

诺如病毒属杯状病毒科、正义单链RNA病毒，基因组大约7.5～7.7kb，包括3个开放阅读框，分别编码非结构蛋白前体、衣壳蛋白VP1和次衣壳蛋白VP2，是最常见的导致病毒性腹泻的主要病原之一。据报道，其最低感染剂量仅为18颗病毒粒子。诺如病毒因其致病剂量低、抗复杂基质能力强、传播途径多样化和丰富的遗传多样性导致其在防控上有一定难度。有研究表明，GII型诺如病毒是引起诺如病毒暴发的主要基因型，其中GII.4是流行中占主导地位，且食堂和餐厅是引起聚集性感染的主要场所。目前，基于诺如病毒的难培养性，即使有相关报道提到了诺如病毒的斑马鱼复制系统，但还没有出现稳定的人源诺如病毒感染模型，仍没有针对诺如病毒开发出有效的疫苗与抗毒药物。因此需要迫切地开发诺如病毒快速检测方法，新型快速、灵敏、特异检测技术的不断发展，是提升我国诺如病毒防控能力的基础，具有重要意义。

目前诺如病毒检测的主流方法仍聚焦于分子检测方法，聚合酶链式反应(PCR)是目前检测各种食源性病毒、致病菌的金标准和主要手段，但PCR技术存在耗时长、设备要求高、并且需要经验丰富的检测人员，在资源匮乏地区的现场检测中受到了极大限制。重组酶介导恒温扩增(RAA)是一种新型的核酸等温扩增技术，与PCR技术不同的是，RAA反应依赖于酶的作用，而非大幅度的温度变化，能够在常温下(39℃左右)20min内完成反应，具有操作简单、反应速度快、特异性高等特点。因此，RAA相对于PCR技术更具有POCT的潜力。

因此，有必要挖掘诺如病毒主要流行基因型的特征性核酸识别靶点，以及建立一种高效、快速检测诺如病毒的检测方法。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种人源诺如病毒GII.4型的特征性核酸鉴别引物组。

本发明的人源诺如病毒GII.4型的特征性核酸鉴别引物组，其包括正向引物、反向引物和探针；

所述的正向引物为RF1或RF2；

所述的反向引物选自RR1-RR4中的任一条；