[发明专利]一种黄姑鱼肠道上皮细胞的培养方法

权利要求书

1.一种黄姑鱼肠道上皮细胞的培养方法，其特征是，包括以下步骤：

（1）将黄姑鱼浸泡禁食，在无菌环境中去除肠道上脂肪和腹膜，分离出肠壁，将肠壁剪碎得到肠道组织块，再用分离液清洗并离心，往肠道组织块中加入固定化蛋白酶消化液，进行酶解消化；结束后培养液交替清洗并离心；将分离所得的细胞加入培养液中，调整细胞浓度，接种到细胞培养板孔中后静止培养；

所述固定化蛋白酶为金属-有机物载体负载连接蛋白酶组合体，其制备方法包括以下步骤：

A.制成初步载体结构：将Zn(NO₃)₂•6H₂O 按照1-1.05 g：70 mL分散在乙醇中，超声处理得到Zn2+溶液；将均苯三甲酸、乙烯基对苯二甲酸及N,N-二甲基甲酰胺按照质量比1：1-1.2：2-4混合均匀得到配位体溶液，然后将配位体溶液迅速倒入Zn2+溶液中，按Zn2+溶液、配位体溶液、四亚乙基五胺溶液体积比1 : 3-4 : 0.6-0.8再加入四亚乙基五胺溶液，升温至130-140℃搅拌2-2.5h后，降至室温得到有序框架结构，接着按有序框架结构、苯乙烯单体、过氧化月桂酰质量比3 : 2-2.5 : 0.5-0.8加入苯乙烯单体与过氧化月桂酰的混合溶液中，得到初步载体结构；

B.选择性溶解配位体：按质量比2-2.5：0.4-0.6往初步载体结构中加入氨基三乙酸三钠，搅拌，分离得到固体，洗涤后干燥得到金属-有机物载体；

C.接枝活性基团：将金属-有机物载体、甲基丙烯酸缩水甘油酯均聚物与γ-环糊精按质量比1：0.6-0.8：1.5-2加入N,N-二甲基甲酰胺中，搅拌反应后，过滤，洗涤，得到活化金属-有机物载体；

D.连接蛋白酶：将活化金属-有机物载体加入到蛋白酶溶液中混合均匀，按活化金属-有机物载与乙二胺质量比1：0.02-0.05加入乙二胺，搅拌，过滤得到固定化蛋白酶；

所述固定化蛋白酶中酶的组分及其在固定化蛋白酶消化液中的浓度为：胶原酶Ⅰ0.25-0.3 mg/ml，胶原酶Ⅳ0.25-0.27 mg/ml，透明质酸酶0.15-0.18mg/mL，胰蛋白酶-EDTA 0.3-0.35%，嗜热菌蛋白酶55-58mg/L；

（2）静止培养后，把培养液连同未贴壁的细胞转入新的细胞培养板继续培养，定期更换培养液，待细胞铺满底壁，再进行传代培养；

（3）传代培养：用质量浓度0.25-0.3%的胰蛋白酶消化液将细胞消化下来，直到细胞回缩、变圆、成团漂浮于消化液中时，用血清终止消化并收集细胞，重复上述两个步骤。

2.根据权利要求1所述的一种黄姑鱼肠道上皮细胞的培养方法，其特征是，步骤（1）中，调整后细胞浓度为3-5×10⁵/ ml。

3.根据权利要求1所述的一种黄姑鱼肠道上皮细胞的培养方法，其特征是，步骤（1）中，细胞培养板孔每孔加入2-2.5 ml细胞液。

4.根据权利要求1所述的一种黄姑鱼肠道上皮细胞的培养方法，其特征是，步骤（1）中，静止培养条件：CO₂环境下，培养箱中26-28℃恒温培养80-90min。

5.根据权利要求1所述的一种黄姑鱼肠道上皮细胞的培养方法，其特征是，所述培养液组分：表皮生长因子0.008-0.012mg/L、胎牛血清4-6%、转铁蛋白0.01-0.03mg/ml、胰岛素218-222U/L、IGF-I 68-72 ng/ml、Gln 298-302mg/L、肝素98-102mg/mL、氢化可的松 0.08-0.12mg/L、青霉素9-12万IU/L和链霉素90-100mg/L。

6.根据权利要求1所述的一种黄姑鱼肠道上皮细胞的培养方法，其特征是，所述培养液组分：表皮生长因子0.01mg/L、胎牛血清5%、转铁蛋白0.02mg/ml、胰岛素220U/L、IGF-I 70ng/ml、Gln 300mg/L、肝素100mg/mL、氢化可的松 0.1mg/L、青霉素10.5万IU/L和链霉素95mg/L。