[发明专利]猪星状病毒的多重RT-PCR引物组、试剂盒及应用

说明书

本发明公开了用于检测猪星状病毒的多重RT‑PCR引物组，包括五对特异性引物，分别是引物PAstV1‑F和PAstV1‑R、引物PAstV2‑F和PAstV2‑R、引物PAstV3‑F和PAstV3‑R、引物PAstV4‑F和PAstV4‑R、引物PAstV5‑F和PAstV5‑R，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.1至SEQ.ID.No.10的碱基序列。据此，发明人还制备了相应的RT‑PCR试剂盒并建立相应的RT‑PCR检测方法。本发明在实际操作中简便，减少了操作次数，极大的避免了交叉污染，节约检测时间和试剂消耗。由于建立的检测方法针对的病毒保守区基因扩增，针对性强，灵敏度高。在临床实验中能够达到简便、经济、便捷和准确的检验要求。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及了一种用于检测猪星状病毒的多重RT-PCR引物组、试剂盒及其应用。

背景技术

猪星状病毒最早于1980通过电子显微镜在猪粪便中检查发现。猪星状病毒不仅是人兽共患传染病，而且与多种动物的肠道腹泻疾病相关，从鸟类到哺乳动物，在到人类都有感染。猪星状病毒常常感染年幼的，年老的及免疫力低下的动物。与此同时，在猪星状病毒的阳性样本中经常检查到轮状病毒、冠状病毒、杯状病毒及其他肠道病毒混合感染造成急性胃肠炎。此外，猪星状病毒基因型繁多，目前已发现有5个基因型(PAstV1-PAstV5)，各基因型序列同源性很低，表明来源于不同的进化分支。虽然各基因型遗传背景差异显著，然而却能够在同一地区，甚至同一头猪体内检出，不同基因型PAstVs混合感染现象普遍。除此之外，不同基因型PAstV的共感染常常导致基因重组现象，具有跨种间传播和人兽共患的可能性。而且PAstV各基因组之间，常常出现多基因型混合感染的情况，有二种或二种以上的基因型感染，进一步加速病毒的遗传变异，为猪星状病毒的监控带来挑战。值得一提的是，猪星状病毒种间屏障可能并不严格，遗传进化分析结果提示猪星状病毒可能跨越了人及其他动物的种间屏障。研究者发现，人星状病毒与猪星状病毒部分ORF2基因存在重组现象，表明猪星状病毒在进化过程中与人星状病毒有密切的关系。所以，建立高效快捷的检测方法，弄清猪星状病毒在猪群中的感染及不同毒株之间的变异，关系对星状病毒的生物学特性，致病机理和预防人兽共患星状病毒感染具有重要的公共卫生学意义。

在当今集约化管理的生产中，猪星状病毒常常出现多基因型混合感染的情况，有二种或二种以上的基因型感染，由于检测方法的单一，同时能检测到是困难的。猪星状病毒的流行病学监测是一项长期的、十分有必要的工作，那么建立一种快速、准确的诊断方法成为PAstV监控的必要条件之一。相比而言，建立多重PCR检测技术能同时扩增多种基因片段，且成本低，快速、价格廉价，无疑是当前最好的检测手段。

发明内容

本发明为解决单RT-PCR操作繁琐、交叉污染风险高的问题，提供一种操作简便、避免叉污染，节约检测时间、试剂消耗、针对性强和灵敏度高的用于检测猪星状病毒多重RT-PCR引物组、试剂盒及其应用，具体方案如下：

用于检测猪星状病毒的多重RT-PCR引物组，包括五对特异性引物，分别是引物PAstV1-F和PAstV1-R、引物PAstV2-F和PAstV2-R、引物PAstV3-F和PAstV3-R、引物PAstV4-F和PAstV4-R、引物PAstV5-F和PAstV5-R，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.1至SEQ.ID.No.10的碱基序列。

用于检测猪星状病毒的多重RT-PCR试剂盒，所述试剂盒包括多重RT-PCR引物组。

所述试剂盒还包括5×buffer、dNTPMix、M-MLVReverseTranscriptae、RNA酶抑制剂、RNA、TarakaEx×Taq、10×ExTaqBuffer、dNTPMix、TemplatecDNA和ddH₂O。

所述的用于检测猪星状病毒的多重RT-PCR引物组在RT-PCR扩增中的应用。