[发明专利]基于CRISPR技术进行多重核酸检测的方法

说明书

本发明提供了基于CRISPR技术进行多重核酸检测的方法，具体地提供了一种基于CRISPR技术检测靶核酸的方法、系统和试剂盒，所述的检测方法包括向含有靶核酸的反应体系中加入第一核酸检测组合物、第二核酸检测组合物、第三核酸检测组合物和第四核酸检测组合物中的任意一种、任意两种、任意三种或四种，以实现对于靶核酸的多重检测。

技术领域

本发明涉及核酸检测领域，涉及基于CRISPR技术进行多重核酸检测的方法，具体涉及基于CRISPR技术进行靶核酸检测的方法、系统和试剂盒，尤其涉及一种基于CRISPR技术进行多重靶核酸检测的方法。

背景技术

特异性检测核酸分子(Nucleic acid detection)方法具有重要的应用价值，例如病原体的检测，遗传病检测等。在病原体检测方面，由于每种病原体微生物都有其独一无二的特征核酸分子序列，因此可以开发出针对特定物种的核酸分子检测，也称为核酸诊断(NADs,nucleic acid diagnostics)，在食品安全、环境微生物污染检测，人体病原菌感染等领域具有重要义。另一个方面是对人或其他物种的单核苷酸多态性(SNPs,singlenucleotide polymorphisms)的检测。在基因组水平上去理解遗传变异和生物学功能之间的关系为现代分子生物学提供了新视角，而其中SNPs对生物学的功能、进化和疾病等密切相关，因此SNPs的检测与分析技术的发展尤为重要。

目前建立的特异性核酸分子检测通常需要分为两步，第一步是目的核酸的扩增，第二步是目的核酸检测。现有检测技术包括限制性核酸内切酶方法、Southern、Northern、斑点杂交、荧光PCR检测技术、LAMP环介导等温扩增技术、重组酶聚合酶扩增技术(RPA)等方法。2012年之后，CRISPR基因编辑技术兴起，张锋团队基于RPA技术开发了一种以Cas13为核心的靶向RNA的新核酸诊断技术(SHERLOCK技术)，Doudna团队开发了一种以Cas12酶为核心的诊断技术(DETECTR技术),中国科学院上海植物生理生态研究所王金博士等也开发了一种基于Cas12的新型核酸检测技术(HOLMES技术)。基于CRISPR技术开发的核酸检测技术正在日益发挥重要作用。

尽管现有核酸检测技术众多，如何更加快速、简便、廉价、精确的检测仍然是改进检测技术的重要方向，尤其是如何对核酸进行多重检测，是亟待解决的问题。

发明内容

本发明提供了一种基于CRISPR技术进行核酸检测的方法，尤其是对核酸进行多重检测的方法、系统和试剂盒。

一方面，本发明提供了一种检测样品中靶核酸的方法，所述方法包括将样品与核酸检测组合物接触，所述核酸检测组合物包括Cas蛋白、gRNA和单链核酸检测器；所述gRNA包括与所述Cas蛋白结合的区域和与靶核酸上的靶序列杂交的导向序列；检测由Cas蛋白切割单链核酸检测器产生的可检测信号，从而检测靶核酸；

所述核酸检测组合物选自第一核酸检测组合物、第二核酸检测组合物、第三核酸检测组合物和第四核酸检测组合物中的任意一种、任意两种、任意三种或四种；

所述第一核酸检测组合物包括Cas12i，可以结合Cas12i以及与靶核酸上的第一靶序列杂交的第一gRNA，和第一单链核酸检测器；

所述第二核酸检测组合物包括Cas12b，可以结合Cas12b以及与靶核酸上的第二靶序列杂交的第二gRNA，和第二单链核酸检测器；

所述第三核酸检测组合物包括Cas12a，可以结合Cas12a以及与靶核酸上的第三靶序列杂交的第三gRNA，和第三单链核酸检测器；

所述第四核酸检测组合物包括Cas12j，可以结合Cas12j以及与靶核酸上的第四靶序列杂交的第四gRNA，和第四单链核酸检测器。