[发明专利]一种高纯度ssDNA制备方法

说明书

本发明公开了本发明提供了一种高纯度ssDNA制备方法；包括以下步骤：第一步：合成所需目的基因到puc57载体中；第二步：磷酸化双链DNA的合成；第三步：l ambda核酸外切酶消化磷酸化双链DNA，得到ssDNA；第四步：通过双链特异性酶去除残留双链DNA，得到高纯度的ssDNA。本发明先是利用l ambda核酸外切酶消化磷酸化单链的方法得到ssDNA，然后在通过双链特异性酶去除残留双链DNA，得到了高纯度无dsDNA残留的ssDNA，克服了残留大量dsDNA的问题；本发明具有简便高效，具有纯度高且无双链DNA残留的优点。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，涉及一种ssDNA制备方法，具体为一种高纯度ssDNA制备方法。

背景技术

基因编辑是一种新兴的比较精确的能对生物体基因组特定目标基因进行修饰的一种基因工程技术。基因编辑技术的最新发展已经改变了我们操作基因组的能力。可编辑位点特异性核酸酶，特别是CRISPR/Cas系统，在目标基因组位置引入双链断裂，然后可以通过选择内源性DNA进行工程机制修复。

CRISPR/Cas9基因编辑工具已经被成功应用于获得基因敲除突变(knockout)，但众多事实证明在基因敲入上的应用有很大的难度。基因敲入所面临的主要难题是修复模板的制备和如何与Cas9-sgRNA核糖核蛋白复合物共导入至细胞。ssDNA常作为“Donortemplate”可实现定点修复和长片段的敲入。研究表明ssDNA作为同源臂具有更高的定点修复和大片段敲入的效率，更易筛选获得定点修复和大片段的敲入的突变体。相比于双链DNA模板具有显著降低基因组随机整合的概率，提高基因编辑效率和更低细胞毒性的优点。但是其制备难度和制备费用都有很大的挑战性。

迄今为止，体外制备单链ssDNA的方法有很多种：例如化学合成；不对称PCR；利用链霉亲和素颗粒分离亲和素标记单链；lambda核酸外切酶消化磷酸化单链；滚环PCR扩增；限制性内切酶剪切质粒后变性等。但这些方法还是会出现混入大量dsDNA的情况。

发明内容

本发明的目的就在于为了解决迄今为止，体外制备单链ssDNA的方法有很多种：例如化学合成；不对称PCR；利用链霉亲和素颗粒分离亲和素标记单链；lambda核酸外切酶消化磷酸化单链；滚环PCR扩增；限制性内切酶剪切质粒后变性等。但这些方法还是会出现混入大量dsDNA的情况，而本发明提供了一种去除大量dsDNA的方法，先是利用lambda核酸外切酶消化磷酸化单链的方法得到ssDNA，然后在通过双链特异性酶去除残留双链DNA，得到了高纯度无dsDNA残留的ssDNA，克服了残留大量dsDNA的问题。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

一种高纯度ssDNA制备方法，包括以下步骤：

第一步：合成所需目的基因到puc57载体中；

第二步：磷酸化双链DNA的合成；

第三步：lambda核酸外切酶消化磷酸化双链DNA，得到ssDNA；

第四步：通过双链特异性酶去除残留双链DNA，得到高纯度的ssDNA。

优选的，合成所需目的基因到puc57载体中具体包括以下步骤:

第一步：根据需要ssDNA序列，通过重叠pcr的原理扩增得到所需DNA序列，得到pcr产物；

第二步：将puc57载体质粒通过ECORV酶使载体线性化，将pcr产物与线性化载体连接，得到重组产物；

第三步：将重组产物取9-11ul转移到T1感受态细胞中，置于冰上8-12min，然后40-44℃热激85-95s，再置于冰上1-5min，加入550-650ulLB培养基，35-39℃，210-230rpm条件下培养38-42min，取90-110ul涂平板，最后37℃过夜培养；