[发明专利]恒温核酸扩增反应管及其应用

说明书

本发明公开了一种恒温核酸扩增反应管，所述反应管包括管体、管盖、和穿刺部件。本发明的恒温核酸扩增反应管，能有效避免二次核酸扩增产生气溶胶污染的可能性，显著增加检测结果的精准性，具有很好的应用前景。

技术领域

本发明涉及医学检测工具技术领域，尤其涉及一种恒温核酸扩增反应管及其应用。

背景技术

重组酶聚合酶扩增(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)是基于重组酶聚合酶介导的扩增原理，模拟体内DNA复制的酶反应过程，依赖特定的酶和蛋白组合(重组酶、单链结合蛋白和DNA聚合酶)对DNA模板进行特异性扩增，是一种恒温核酸扩增技术，可在接近体温条件下实现快速特异性扩增(36℃-42℃，5-30min)，作为一种恒温技术减少了对高精度昂贵仪器、稳定电力供应设施及高级别实验室的依赖，只需要一个恒温装置就可完成，且可通过荧光分析装置判别是否存在扩增产物，具有对设施和操作要求均较为简单的特点，已广泛应用于生命科学研究、医学检测、农业、食品安全、转基因检测等多个领域。

为了进一步提高RPA的检测灵敏度，有研究者提出了巢式RPA检测方法(nestRPA)(Wanqiu Huang,Dachuan Lin,Cuini Wang,Chaohui Bao,Zhaoqi Zhang,Xinchun Chen,Zheng Zhang,Jian Huang#.The determination of release from isolation of COVID-19patients requires ultra-high sensitivity nucleic acid test technology.JInfect.2020Jul 2；S0163-4453(20)30456-4.doi:10.1016/j.jinf.2020.06.075.)，nestRPA的基本原理是：先用外引物扩增目的基因第一片段，然后用内引物扩增完全位于第一扩增片段内的目的基因第二片段。为了消除酶的荧光信号影响，在第一次的RPA反应体系中不包含荧光探针。在第二次RPA反应中，加入荧光探针。经实验证实nestRPA具有超高灵敏度，将为新冠病毒、流感病毒、猪瘟病毒等各种病毒的尽早发现提供有力的技术支撑。但是，nestRPA要经两次RPA反应，第一次RPA反应完之后，需打开反应管盖子，加入第二次RPA反应所需的内引物和探针等，再盖上反应管盖子进行第二次RPA反应，直至反应结束检测结果。其中，在第一次RPA反应完之后打开反应管盖子的过程中，容易产生核酸气溶胶污染，导致假阳性结果。因此，急需开发一种可以“一管法”完成nestRPA的反应管，在第一次RPA反应完之后无需打开反应管盖子，就可进行第二次RPA反应。

发明内容

本发明要解决目前用于巢式RPA检测的反应管容易产生核酸气溶胶污染的技术问题，提供一种恒温核酸扩增反应管，该反应管能有效避免巢式RPA检测过程中的开盖操作，防止核酸扩增产生气溶胶而造成样本间的核酸污染，使检测结果更加精准。

为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现:

在本发明的一个方面，提供了一种恒温核酸扩增反应管，所述反应管包括管体、管盖、和穿刺部件，该穿刺部件设置于管体入口处内侧。

优选的，所述穿刺部件为空心圆锥体形状，在其圆锥侧面上设有多个孔洞，以利于液体离心后下沉管底。

所述管盖的开口可用封口膜密封，所述封口膜包括耐热薄膜型封口膜。

所述管盖的顶端可开设有加样口。

所述管盖在其底部预先密封可刺破封口膜的前提下，管盖内部可通过管盖顶端的加样口加入反应液体。

在本发明的另一个方面，提供了一种应用上述恒温核酸扩增反应管进行巢式RPA检测的方法，包括以下步骤：

将第一次RPA反应的反应体系加入管盖内，再用封口膜封住管盖开口，然后将其置于恒温扩增仪中进行第一次RPA反应；