[发明专利]一种靶向捕获遗传性耳聋基因序列的方法及测序方法

权利要求书

1.一种靶向捕获遗传性耳聋基因序列的方法，其特征在于，所述方法包括：

1)制备靶向捕获遗传性耳聋基因外显子序列正负链的捕获膜，所述遗传性耳聋基因包括CDH23、COL11A1、DSPP、MYO7A、OTOF、PCDH15、MT-RNR1、MT-TL1、MT-TS1、MYO15A、SLC26A4、DFNA5、GJB2、GJB3、KCNJ10、SOX10、TCOF1、WFS1、DFNB59、USH1G、TMC1、DFNB31；

2)将片段化后的人基因组样品，构建为应用于高通量测序的核酸文库；

3)将所述核酸文库进行变性处理，变性处理后的核酸文库与所述的捕获膜在杂交条件下进行杂交，形成目标核酸分子-捕获膜复合物；

4)用清洗液清洗所述目标核酸分子-捕获膜复合物，然后再用洗脱液从捕获膜上洗脱、并纯化经富集后，获得遗传性耳聋基因序列。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述捕获膜是基于尼龙膜或其衍生物膜、醋酸纤维素膜或其衍生物膜、或纤维素纸膜或其衍生物膜；优选为中性或带正电的尼龙膜、醋酸纤维素膜、或纤维素纸膜。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述捕获膜上结合有与所述遗传性耳聋基因外显子序列相似度在90％以上的核酸探针文库。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述核酸探针文库的制备通过以下步骤制得：

获取并纯化具有遗传性耳聋基因相同、互补、相似的核酸序列，经片段化，形成20bp～10kb片段范围，优选150bp～800bp的片段；

经片段化处理后再通过物理或化学方式变性，即得核酸探针文库。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述遗传性耳聋基因外显子序列正负链通过物理、化学、光化学方式中的一种或多种与膜进行结合，形成捕获膜。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述杂交条件是指在温度范围为40摄氏度到70摄氏度的杂交液中进行杂交，以实现目标核酸分子与核酸探针在该温度和杂交液中能进行结合，其中优选温度为55到65摄氏度。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述杂交液为含有磷酸钠缓冲溶液、EDTA、BSA和SDS的溶液，或含有柠檬酸钠缓冲液(SSC)、Denhardt solution、SDS、甲酰胺的溶液中的一种或多种混合，或含有SSPE、Denhardt solution、SDS、甲酰胺的溶液中的一种或多种混合；优选杂交液为含0.5M磷酸钠缓冲溶液、1mM EDTA、1％(w/v)BSA和7％(w/v)SDS的溶液，或含有5×柠檬酸钠缓冲液(5×SSC),5×Denhardt solution和1％(w/v)SDS的溶液。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述清洗液为含有磷酸钠缓冲溶液和SDS的溶液，或含有0.2～2x SSC和1％(w/v)SDS的溶液；优选清洗液为含有0.04M磷酸钠缓冲溶液和1.6％(w/v)SDS的溶液，或含有2x SSC和0.1％(w/v)SDS的溶液，或含有0.2x SSC和0.1％(w/v)SDS的溶液，或含有0.1x SSC和0.1％(w/v)SDS的溶液。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述洗脱液为水、TE缓冲溶液、0.4M NaOH溶液、或0.1％(w/v)SDS溶液。

10.一种对靶向捕获遗传性耳聋基因序列的测序方法，其特征在于，所述方法包括：

制备靶向捕获遗传性耳聋基因外显子序列正负链的捕获膜，所述遗传性耳聋基因包括CDH23、COL11A1、DSPP、MYO7A、OTOF、PCDH15、MT-RNR1、MT-TL1、MT-TS1、MYO15A、SLC26A4、DFNA5、GJB2、GJB3、KCNJ10、SOX10、TCOF1、WFS1、DFNB59、USH1G、TMC1、DFNB31；

获取片段化后的人基因组样品，构建为应用于高通量测序的核酸文库；

将所述核酸文库进行变性处理，变性处理后的核酸文库与所述的捕获膜在杂交条件下进行杂交，形成目标核酸分子-捕获膜复合物；

用清洗液清洗所述目标核酸分子-捕获膜复合物，然后再用洗脱液从捕获膜上洗脱、并纯化经富集后，获得遗传性耳聋基因序列；

将所述遗传性耳聋基因序列进行高通量测序。