[发明专利]一种基于荧光RMA法检测结核分枝杆菌核酸的引物探针组、试剂盒及其检测方法

说明书

本申请属于生物检测技术领域，具体为一种基于荧光RMA法检测结核分枝杆菌核酸的引物探针组、试剂盒及其检测方法；所述引物探针组包括检测结核分枝杆菌的引物和探针，所述探针上标记的荧光报告基团是FAM，荧光淬灭基团是BHQ1；所述试剂盒中包括有：含有扩增反应试剂的检测管、缓冲液、醋酸镁、标准阳性质粒、无菌双蒸水；所述扩增反应试剂单管分装，为干粉形态，包括RMA引物对及检测探针组、大肠杆菌RecA蛋白、UvsY蛋白、单链结合蛋白GP32、Bst聚合酶、核酸外切酶III、聚环氧乙烷、海藻糖、甘露醇、ATP、dNTPs、肌酸激酶和磷酸肌酸。

技术领域

本申请属于生物检测技术领域，具体为一种基于荧光RMA法检测结核分枝杆菌核酸的引物探针组、试剂盒及其检测方法。

背景技术

结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)简称为结核杆菌(tuberclebacilli)，可通过呼吸道、消化道或皮肤损伤侵入易感机体，引起多种组织器官的结核病，其中以通过呼吸道引起肺结核为最多。肺结核的临床表现多种多样，早期症状轻，不典型，容易与其它呼吸系统疾病，如气管炎、肺炎等疾病混淆，经常被忽略而导致就诊延迟。因此快速准确检测结核杆菌感染对结核病的预防和治疗极为重要。

结核病常见的诊断方法有痰涂片镜检法、痰结核菌培养、结核菌素纯蛋白衍化物(PPD)试验、分子生物学方法等。痰涂片镜检法简单、快速，但灵敏度和特异度都达不到要求；痰结核菌培养是诊断结核病的金标准，但费时较长，一般为2-8周，临床上少用；PPD试验阳性不能区分是结核分枝杆菌的自然感染还是卡介苗接种的免疫反应；分子生物学方法主要是荧光定量PCR和LAMP恒温扩增法，但PCR方法需要使用复杂的仪器和装备精良的实验室，一定程度上限制了其推广应用，而LAMP方法对引物的要求较高，且特别容易形成气溶胶污染，造成假阳性影响检测结果。

重组酶介导扩增(Recombinase MediatedAmplification,RMA)技术，是近年来发展出的一种敏感、特异、简便、快捷的等温核酸扩增技术，被认为是可替代PCR的核酸检测技术，主要依赖重组酶、单链DNA结合蛋白(SSB)和链置换DNA聚合酶三种酶。RMA反应可以在37～42℃进行，整个过程在30min内即可达到检测水平，可实现结核分枝杆菌的快速检测。

发明内容

为了解决现有技术的问题，本申请提供了一种基于荧光RMA法检测结核分枝杆菌核酸的引物探针组、试剂盒及其检测方法，本申请是通过下述方案实现的：

一种基于荧光RMA法检测结核分枝杆菌核酸的引物探针组，包括检测结核分枝杆菌的引物和探针，其中，

正向引物：5’-TTCTCTCGGATTGACGGTAGGTGGAGAAGAAGC-3’；

反向引物：5’-CCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAAT-3’；

探针：

5’-ATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGG(FAM-dT)C(THF)C(BHQ1-dT)GGGCAGTAACTGA(C3-spacer)-3’。

优选的，所述探针上标记的荧光报告基团是FAM，荧光淬灭基团是BHQ1。

一种基于荧光RMA法检测结核分枝杆菌核酸的试剂盒，该试剂盒中包括有：含有扩增反应试剂的检测管、缓冲液、醋酸镁、标准阳性质粒、无菌双蒸水。

优选的，所述扩增反应试剂单管分装，为干粉形态，所述扩增反应试剂包括RMA引物对及检测探针组、大肠杆菌RecA蛋白、UvsY蛋白、单链结合蛋白GP32、Bst聚合酶、核酸外切酶III、聚环氧乙烷、海藻糖、甘露醇、ATP、dNTPs、肌酸激酶和磷酸肌酸。