[发明专利]一种基于荧光RMA法检测日本血吸虫核酸的引物探针组、试剂盒及其检测方法

说明书

本申请属于生物检测技术领域，具体为一种基于荧光RMA法检测日本血吸虫核酸的引物探针组、试剂盒及其检测方法；包括检测日本血吸虫的引物对及对应的探针，所述日本血吸虫的检测探针上标记的荧光报告基团是VIC，荧光淬灭基团是BHQ1；该试剂盒中包括含有扩增反应试剂的检测管、缓冲液、醋酸镁、标准阳性质粒、无菌双蒸水；所述扩增反应试剂单管分装，为干粉形态，包括RMA引物对及检测探针组、大肠杆菌RecA蛋白、UvsY蛋白、单链结合蛋白GP32、Bst聚合酶、核酸外切酶III、聚环氧乙烷、海藻糖、甘露醇、ATP、dNTPs、肌酸激酶和磷酸肌酸。

技术领域

本申请属于生物检测技术领域，具体为一种基于荧光RMA法检测日本血吸虫核酸的引物探针组、试剂盒及其检测方法。

背景技术

血吸虫病是一种具有严重危害的人兽共患寄生虫病，广泛分布于亚洲、非洲、南美洲和中东国家。现主要存在6种寄生于人体的血吸虫：日本血吸虫、曼氏血吸虫、埃及血吸虫、间插血吸虫、湄公血吸虫和马来血吸虫。在我国血吸虫病的病原是日本血吸虫(Schistosoma japonicum)，日本血吸虫病主要在中国长江流域和长江以南十三个省、直辖市、自治区流行。日本血吸虫属于扁形动物门、吸虫纲、复殖目、裂体科、血吸虫属、日本裂体吸虫种，雌雄异体。日本血吸虫能够逃避宿主的免疫攻击，在宿主的血管中存活长达十几年甚至更长时间，血吸虫感染能引起人和家畜的消瘦，重度感染可以造成人和家畜极高的发病率和死亡率。血吸虫病的诊断是血吸虫病防治的中心环节，对化疗目标人群的确定及化疗效果评价、有效控制传染源和降低虫卵对环境的污染具有重要意义。

目前日本血吸虫的检测主要有病原学诊断、免疫学诊断、分子生物学方法。传统的病原学诊断方法如毛蚴孵化法阳性率极低，漏检以及误诊较为常见；免疫学诊断如环卵沉淀试验、间接血凝试验、酶联免疫吸附试验(ELISA)等由于检测的是血吸虫感染后宿主体内产生的抗体，抗体检测窗口期长，不能区分现症感染和既往感染；分子生物学方法主要是荧光定量PCR和LAMP恒温扩增法，但PCR方法需要使用复杂的仪器和装备精良的实验室，一定程度上限制了其推广应用，而LAMP方法对引物的要求较高，且特别容易形成气溶胶污染，造成假阳性影响检测结果。

重组酶介导扩增(Recombinase MediatedAmplification,RMA)技术，是近年来发展出的一种敏感、特异、简便、快捷的等温核酸扩增技术，被认为是可替代PCR的核酸检测技术，主要依赖重组酶、单链DNA结合蛋白(SSB)和链置换DNA聚合酶三种酶。RMA反应可以在37～42℃进行，整个过程在30min内即可达到检测水平，可实现日本血吸虫的快速检测。

发明内容

为了解决现有技术的问题，本申请提供了一种基于荧光RMA法检测日本血吸虫核酸的引物探针组、试剂盒及其检测方法，本申请是通过下述方案实现的：

一种基于荧光RMA法检测日本血吸虫核酸的引物探针组，包括检测日本血吸虫的引物对及对应的探针，其中，

正向引物：5’-GGACCATGAGTGTTACTAACCGGCTGTAGTGGA-3’；

反向引物：5’-AGCTCACATACGCAACTGCCAACGTGACATAAA-3’；

探针：

5’-TGTCGGAGATGGCGGCTTCACGTGCGTGC(VIC-dT)(THF)(BHQ1-dT)GTCCTTCGGGCATTA(C3-spacer)-3’。

优选的，所述日本血吸虫的检测探针上标记的荧光报告基团是VIC，荧光淬灭基团是BHQ1。

一种基于荧光RMA法检测日本血吸虫核酸的试剂盒，该试剂盒中包括有：含有扩增反应试剂的检测管、缓冲液、醋酸镁、标准阳性质粒、无菌双蒸水。