[发明专利]一种变异链球菌特异性靶向抗菌肽及其应用

权利要求书

1.变异链球菌特异性靶向的抗菌肽，其特征在于变异链球菌特异性靶向抗菌肽的氨基酸序列为TFFRLFNRGGGRRWWRF。

2.根据权利要求1所述的变异链球菌特异性靶向的抗菌肽制备方法，其特征在于包括如下步骤：

S1:称取适量Wang树脂加入反应柱，加入二氯甲烷(DCM)使树脂充分溶胀，二甲基甲酰胺(DMF)清洗之后抽掉DCM，然后用配制好的去保护剂去除树脂上的Fmoc保护基团脱帽，脱帽时间20分钟，之后用DMF洗3次，验色为蓝色则Fmoc保护基团成功去掉，如无色则表示没反应上，需要重新脱帽；

S2:按照权利要求1所述抗菌肽的氨基酸序列加入第二种氨基酸精氨酸，并加入缩合剂HBTU(苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯)和催化剂NMM(N-甲基吗啡啉)或DIEA(N,N二异丙基乙胺)进行缩合反应；反应结束后加入DMF进行反复洗涤，除去未反应的氨基酸；

S3:茚三酮检测连接是否完全，检测结果是溶液亮黄，树脂透明，无杂色；

S4:洗涤后所得产物按照步骤1同样方法进行脱帽、洗涤，依照上述步骤2按照氨基酸序列依次加入氨基酸进行缩合反应、洗涤，将所有的氨基酸连接结束后采用S1方法脱去最后的Fmoc-保护基团，DMF洗涤；

S5:反应结束分别用DCM和甲醇(MeOH)洗涤收缩，后加入三氟乙酸TFA进行裂解，对裂解后的产物进行过滤后得到滤液；

S6：根据S6得到的滤液中加入其3倍体积的冰乙醚(4℃)促使多肽析出，密封后颠倒混匀，回收沉淀；用冷乙醚重悬沉淀，重复上述步骤三次，之后将所得沉淀干燥后得到多肽粗品；

S7:合成肽粗品的纯化：采用反相高效液相法对粗品进行纯化并冷冻干燥；

S8:纯化干燥后的抗菌肽用高效液相色谱(HPLC)测定纯度并用质谱(MS)检测分子质量与理论计算的分子量相符。

3.根据权利要求1所述的变异链球菌特异性靶向的抗菌肽，其特征在于：所述变异链球菌特异性靶向的抗菌肽是将CSP片段与短链的人工抗菌肽结合形成，肽链更短。

4.根据权利要求1或3所述的变异链球菌特异性靶向的抗菌肽的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)测定，其特征在于：

(1)挑取单菌落于10mLBHI培养基中，置于恒温厌氧培养罐中37℃过夜厌氧培养80％N₂，10％H₂,10％CO₂；

(2)吸取100μL过夜菌液加入10mL培养基，置于恒温厌氧培养罐中37℃过夜厌氧培养(80％N₂，10％H₂,10％CO₂)，将菌液稀释至2×10⁶CFU/mL备用；

(3)采用2倍稀释法在96孔板中加入权利要求1或3所述的变异链球菌特异性靶向的抗菌肽溶液20μL，BHI培养基80μL和备用菌液100μL，使多肽最终浓度为512μg/mL～0.5μg/mL，将孔板置于恒温厌氧培养罐中37℃厌氧培养80％N₂，10％H₂,10％CO₂24小时；

(4)MIC为96孔板内澄清的最低多肽浓度；

(5)吸取澄清孔内100μL菌液涂布于BHI琼脂平板，置于恒温厌氧培养罐中37℃过夜厌氧培养80％N₂，10％H₂,10％CO₂48小时；

(6)MBC为平板无菌落形成的最低多肽浓度；

(7)氯己定作为阳性对照，BHI培养基作为阴性对照；

(8)实验重复3次，每组设3个平行样。