[发明专利]一种寨卡病毒的检测方法和试剂盒

权利要求书

1.一种非诊断目的的寨卡病毒的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤1：在待测样品、阳性对照样品、阴性对照样品中加入连接酶、锁式探针和连接试剂，使所述待测样品与所述阳性对照样品中的核酸与所述锁式探针连接成环，得到连接产物，所述锁式探针的序列如SEQIDNO：2所示；

步骤2：在所述连接产物中加入DNA聚合酶、第一引物、第二引物以及扩增试剂，得到扩增产物，所述第一引物的序列如SEQIDNO：3所示，所述第二引物的序列如SEQIDNO：4所示；

步骤3：在所述扩增产物中加入Cas蛋白酶、第一向导RNA、第二向导RNA、荧光探针以及切割试剂，得到切割产物，

所述第一向导RNA的序列如SEQIDNO：5所示，所述第二向导RNA的序列如SEQIDNO：6所示，所述荧光探针的序列如SEQIDNO：7所示，且其5’端和3’端分别使用荧光基团和淬灭基团修饰，所述荧光基团为Fam，所述淬灭基团为dab；

步骤4：对所述切割产物进行荧光检测，根据所述待测样品、阳性对照样品、阴性对照样品的荧光信号判断待测样品中是否含有寨卡病毒。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述阳性对照样品为寨卡假病毒，所述寨卡假病毒中包括寨卡病毒NS5蛋白的基因，所述基因的序列如SEQIDNO：1所示。

3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述阴性对照样品为无核酸酶水。

4. 根据权利要求1-3任一项所述的检测方法，其特征在于，步骤1中，所述连接酶的酶活力为25U/μL，所述锁式探针的浓度为1-100 nM，所述连接试剂包括50mM Tris-HCl、5 mMMgCl₂、10mM DTT、10-100mM ATP。

5.所述的根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述连接酶为PBCV-1 DNA 连接酶或T4 RNA 连接酶。

6. 根据权利要求1-3任一项所述的检测方法，其特征在于，步骤2中，所述DNA聚合酶的酶活力为1U/μL、第一引物的浓度为50-500nM、第二引物的浓度为50-500nM；所述扩增试剂包括50 mM Tris-HCl、10 mM MgCl₂、10 mM (NH₄ )₂SO₄、4 mM DTT、1mM dNTP、0.2mg/mlBSA。

7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述DNA聚合酶为phi29 DNA 聚合酶或Bst DNA聚合酶。

8.根据权利要求1-3任一项所述的检测方法，其特征在于，步骤3中，Cas蛋白酶的浓度为50-200nM、第一向导RNA和第二向导RNA的浓度为100-400nM，荧光探针的浓度为500nM-1μM，所述切割试剂包括50mM Tris-HCl、100mM NaCl、10mM MgCl₂和100 μg/ml BSA。

9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，所述Cas蛋白为Cas12a蛋白酶、FnCas12a蛋白酶、AsCas12a蛋白酶、LbCas12a蛋白酶、AacCas12b蛋白酶和Cas14蛋白酶中的一种。

10.一种用于检测寨卡病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1-9任一项所述检测方法所使用的试剂，所述试剂包括阳性对照样品、阴性对照样品、连接酶、锁式探针、连接试剂、DNA聚合酶、第一引物、第二引物、扩增试剂，Cas蛋白酶、第一向导RNA、第二向导RNA、荧光探针以及切割试剂；

所述连接酶、锁式探针和连接试剂用于将待测样品与所述阳性对照样品中的核酸与所述锁式探针连接成环，得到连接产物，所述锁式探针的序列如SEQIDNO：2所示；

所述DNA聚合酶、第一引物、第二引物以及扩增试剂用于扩增所述连接产物得到扩增产物，所述第一引物的序列如SEQIDNO：3所示，所述第二引物的序列如SEQIDNO：4所示；

所述Cas蛋白酶、第一向导RNA、第二向导RNA、荧光探针以及切割试剂用于切割所述扩增产物得到切割产物，所述第一向导RNA的序列如SEQIDNO：5所示，所述第二向导RNA的序列如SEQIDNO：6所示，所述荧光探针的序列如SEQIDNO：7所示，且其5’端和3’端分别使用荧光基团和淬灭基团修饰，所述荧光基团为Fam，所述淬灭基团为dab。