[发明专利]一种尖头鱥精子高效超低温冷冻保存方法

说明书

本发明属水产养殖技术领域，具体地说是一种尖头鱥精子高效超低温冷冻保存方法。将尖头鱥鱼的精液与抗冻液按体积比1:40的比例混合，混合后经过程序降温处理，最终投入到液氮(‑196℃)，分装保存；抗冻液由稀释液、抗冻剂两部分组成。本发明获得的冻精对于尖头鱥人工繁育、种质保存、遗传多样性保护及可持续养殖等方面有着重要意义。

技术领域

本发明属水产养殖技术领域，具体地说是一种尖头鱥精子高效超低温冷冻保存方法。

技术背景

尖头鱥(Rhynchocypris oxycephalus)，又名木叶鱼，是一种广布于东亚的冷水性小型鲤科鱼类，主要栖息于海拔较高、水温较低、溶氧较高，有一定水流速度且水质清澈的溪流上游或山涧溪流，为四川省山区溪流常见种或优势种。尖头鱥对栖息环境的高要求造就了其肉质细嫩、味道鲜美的特点，且肌间刺少，营养价值高，深受广大消费者喜爱，市场价格高达100-150元/斤。目前市场销售的尖头鱥主要来自自然群体，但尖头鱥自然种群数量小，加之繁殖投入低，生态耐受力弱，尤其对温度变化异常敏感和脆弱，在面对人类干扰和环境变化时极易濒危和灭绝。因此，不论是基于土著经济鱼类新品种的开发推广，还是自然种群的保护，尖头鱥的人工繁育技术研发都迫在眉睫。鱼类精液的超低温保存在遗传育种以及种质资源保存中具有重要的意义，可以使种质的长距离运输得以实现，有利于鱼类的选育以及基因多样性的保护。建立尖头鱥精子的超低温冷冻技术，无论是对其人工繁育，还是遗传多样性的保护，都有着迫切的需求。

发明内容

本发明的目的在于提供一种尖头鱥精子高效超低温冷冻保存方法。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

将尖头鱥的精液与抗冻液按体积比1:40的比例混合，混合后经过程序降温仪分步降温处理，最终投入到液氮(-196℃)，分装保存；抗冻液由稀释液、抗冻剂两部分组成，其中稀释液为NaCl 9.00g/L，KCl 0.42g/L，CaCl₂ 0.24g/L，MgSO₄·7H₂O 0.15g/L，NaHCO₃0.20g/L，NaH₂PO₃ 0.05g/L，牛磺酸4.5g/L溶液；抗冻剂为35％(抗冻剂的终浓度；V/V)DMSO(二甲基亚砜)。

所述稀释液为取NaCl 9.00g，KCl 0.42g，CaCl₂ 0.24g，MgSO₄·7H₂O 0.15g，NaHCO₃ 0.20g，NaH₂PO₃ 0.05g，牛磺酸4.5g加入蒸馏水充分溶解，后放入定量瓶中中定量至1L即得；所述抗冻液为取配置好的稀释液650mL，加入350mLDMSO(二甲基亚砜)，充分混匀即得。

选用0.5mL的麦管，每管加入500μL提前5min按1:40体积比混匀的尖头鱥精液与抗冻液混合液，麦管开口处迅速蘸取四氢呋喃溶解的PVC塑料1-2秒钟，放入4℃冰箱预冷1min，使抗冻保护剂充分渗入细胞中。

将分装后的混合液放入程序降温仪，然后按照-25℃/min的降温程序降温至-100℃，再迅速投入液氮中保存。

解冻时将麦管用镊子从液氮中捞出，然后迅速将麦管放入15℃恒温水浴锅中水浴解冻10-15秒，轻轻摇动使其受温均匀，解冻后迅速取出。

用剪刀剪断麦管两端，让精液混合液流入到载玻片中，加入Actifish精子活力激活液激活精子，镜检其活力。

本发明与现有技术相比，具有如下有益效果：

一、本发明冷冻保存过程中采用DMSO作抗冻剂，保持较好渗透性的同时又降低了毒性；

二、本发明冷冻保存过程中采用0.5mL麦管，渗透性好，温度变化敏感，能够精准控制降温速率；