[发明专利]分子标记及其应用和鉴定无患子与毛瓣无患子种质的方法

权利要求书

1.一种用于鉴定无患子与毛瓣无患子种质SSR分子标记引物，其特征在于，所述SSR分子标记引物为以下5对序列：

Samuk10G0092500：

上游引物：5'- TTCTTCCGATTGAGCGCCAT-3'；

下游引物：5'- CGAATCCAGTGGCAGTAGCA-3'；

Samuk04G0084900：

上游引物：5'- CTAGCTGTGGGGGCACATAC-3'；

下游引物：5'- GCATATTAGCACCGACCGGA-3'；

Samuk07G0006800：

上游引物：5'- GAAGCCGGATCTAATGGGCA-3'；

下游引物：5'- TCACTCCAACAGCCTTGTCC-3'；

Samuk12G0105900：

上游引物：5'- AGGAGATTCAAGTGGTGGCG-3'；

下游引物：5'- GACGACGTACACTGCTCCAT-3'；

Samuk03G0235800：

上游引物：5'- CAGTCCGATCTCAGCAGCAT-3'；

下游引物：5'- TTGCCCTAGGGTGTTCTTGG-3'。

2.一种权利要求1所述的SSR分子标记引物的应用，其特征在于，包括以下步骤：

1）提取待测无患子或毛瓣无患子幼嫩叶片样品的DNA；

2）以步骤1）提取的DNA为模板，根据SSR分子标记进行PCR扩增；

3）毛细管电泳上机检测；

取步骤2）所得PCR产物0.3 μL、分子量内标0.5 μL和去离子甲酰胺9.5μL混合加入PCR板，95℃变性5min，4℃冷却后离心，1×Buffer缓冲液上机检测；

4）对样品的原始数据进行分析，获得不同样品扩增片段的长度；进一步分析数据，获得引物多态性，将每对引物获得的等位基因利用阿拉伯数字0/1开始赋值，建立无患子与毛瓣无患子种质0/1矩阵，计算遗传距离，构建系统发育树；

5）根据检测种质扩增产物结果判定其为无患子或毛瓣无患子。

3.根据权利要求2所述应用，其特征在于，所述步骤2）中，

所述PCR扩增采用20μL反应体系：包括10-50ng模板DNA 1-2 μL，正、反向引物分别为0.2μL 和0.2μL，睿博兴科2×Taq Plus PCR 反应混合物10μL，及适量ddH₂O；

PCR反应程序为：95℃预变性5 min，95℃变性30 s，退火温度52 ℃复性30 s，72 ℃延伸 30 s，95 ℃变性30 s，退火温度50 ℃复性30 s，72 ℃延伸 30 s，20次循环后72 ℃延伸10 min；4 ℃存储。

4.根据权利要求2所述应用，其特征在于，所述步骤3）中，上机检测所用仪器为基因分析仪ABI 3730XL DNA analyzer、毛细管 ABI 96×50 cm 4331246。

5.根据权利要求4所述应用，其特征在于，所述基因分析仪参数设置如下：

模块文件: GeneMapper50_POP7_1；

运行电压: 15.0kv；

进样电压: 1.6kv；

进样持续时间: 15sec；

温度: 63DegC；

电流稳定度: 30.0uA。

6.根据权利要求2所述应用，其特征在于，所述步骤4）具体为：对样品的原始数据用GeneMarker V2.2.0软件进行分析，获得不同样品扩增片段的长度；利用软件PopGen32分析数据，获得引物多态性，将每对引物获得的等位基因利用阿拉伯数字0/1开始赋值，建立无患子与毛瓣无患子种质0/1矩阵，利用Nysts软件计算遗传距离，利用Clustering模块SAHN功能构建系统发育树。

7.一种利用权利要求1所述SSR分子标记引物鉴定无患子与毛瓣无患子种质的方法，其特征在于，步骤如下：

1）提取待测无患子或毛瓣无患子幼嫩叶片样品的DNA；

2）以步骤1）提取的DNA为模板，根据所述分子标记进行PCR扩增；

所述PCR采用20μL反应体系：包括10-50ng模板DNA 1-2 μL，正、反向引物分别为0.2μL和0.2μL，睿博兴科2×Taq Plus PCR 反应混合物10μL，及适量ddH₂O；所述反应混合物为MgCl₂：3 mM；dNTPs：0.4 mM；

PCR反应程序为：95℃预变性5 min，95℃变性30 s，退火温度52 ℃复性30 s，72 ℃延伸 30 s，95 ℃变性30 s，退火温度50 ℃复性30 s，72 ℃延伸 30 s，20次循环后72 ℃延伸10 min；4 ℃存储；

3）毛细管电泳上机检测；

取步骤2）PCR产物0.3 μL、分子量内标0.5 μL和去离子甲酰胺9.5μL混合加入PCR板，95℃变性5min，4℃冷却后离心，1×Buffer缓冲液上机检测；上机检测仪器：基因分析仪ABI3730XL DNA analyzer、毛细管 ABI 96×50 cm 4331246；

4）电泳结束后，对样品的原始数据用 GeneMarker V2.2.0软件进行分析，获得不同样品扩增片段的长度；利用软件PopGen32分析数据，获得引物多态性，将每对引物获得的等位基因利用阿拉伯数字0/1开始赋值，建立无患子与毛瓣无患子种质0/1矩阵，利用Nysts软件计算遗传距离，利用Clustering模块SAHN功能构建系统发育树；

5）根据检测种质扩增产物结果判定其为无患子或毛瓣无患子。