[发明专利]一种N-乙酰神经氨酸生产稳定性提高的重组枯草芽孢杆菌

说明书

本发明公开了一种N‑乙酰神经氨酸生产稳定性提高的重组枯草芽孢杆菌，属于枯草芽孢杆菌代谢工程和基因工程技术领域。本发明通过将两个单输出细胞亚群调控回路组合，构建了一种可以提高亚群调控回路稳定性的的双输出亚群调控回路。在双输出亚群调控回路中，存在两个传感器启动子P_veg105作为输出启动子，只有当两个P_veg105同时发生遗传突变，细胞亚群调控回路才会失效，这增加了亚群调控回路的稳定性。所得到的重组枯草芽孢杆菌可以在96h的连续传代发酵培养过程中一直维持NeuAc生产，且产量稳定在0.65‑0.90g/L。

技术领域

本发明涉及一种N-乙酰神经氨酸生产稳定性提高的重组枯草芽孢杆菌，属于枯草芽孢杆菌代谢工程和基因工程技术领域。

背景技术

目前在实验室小试规模可以实现利用微生物细胞工厂生产多种目标化合物，但是能实现商业化应用的生物过程很少。从实验室小试规模放大到工业生产规模的过程中，由于遗传突变导致的遗传异质性、复杂调控的表型异质性、以及发酵过程中难以控制的环境异质性等原因，由一个单克隆细胞发展而来的生产群体在发酵过程中存在生产和非生产细胞。生产细胞因生产负担常常表现为降低的适应能力，因此，更加具有生长优势的非生产细胞在发酵过程中会逐步取代生产细胞，从而占据整个生物反应器，降低微生物细胞工厂的生产稳定性，这限制了很多生物过程的工业化应用。目前虽已开发有细胞亚群调控回路富集发酵过程中的生产细胞亚群，但是他们都是用单拷贝的传感器启动子调控生长关键基因来赋予生产细胞生长优势。单拷贝的传感器启动子的遗传突变可导致亚群调控回路失效，因此有待开发更稳定的亚群调控回路，从而进一步提高重组菌的生产稳定性。枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是革兰氏阳性菌的模式微生物，由于它的GRAS身份，以及生长速率快、发酵培养时间短、培养条件要求低、易于进行代谢工程改造和分泌蛋白质能力强等等优势，在工业上应用十分广泛，在生产蛋白和高附加值化合物的生产上具有非常重要的地位。N-乙酰神经氨酸(NeuAc)又名唾液酸，燕窝酸，是一种重要的营养添加剂和药物中间体，在促进婴儿大脑发育，维持大脑健康和增强免疫力方面发挥着关键作用。此种NeuAc生产稳定性提高的重组枯草芽孢杆菌菌株的构建不仅为高附加值化合物NeuAc发酵法大规模生产奠定了基础，还为枯草芽孢杆菌的代谢工程改造提供新的有效方法。

发明内容

技术问题

现有技术中，使用单拷贝的传感器启动子调控生长关键基因来赋予生产细胞生长优势，没有考虑到细胞生长过程中单拷贝的传感器启动子易发生遗传突变，影响传代和生产的稳定性。

技术方案

提供一种提高重组枯草芽孢杆菌N-乙酰神经氨酸生产稳定性的方法。本发明通过将两个单输出细胞亚群调控回路组合，构建了一种可以提高亚群调控回路稳定性的的双输出亚群调控回路。

本发明的第一个目的是提供一种双输出亚群调控回路，所述调控回路是包含第一必需基因调控模块和第二必需基因调控模块的质粒。

在一种实施方式中，所述必需基因包括但不限于二氢蝶呤醛缩酶基因folB、SEDS家族肽聚糖糖基转移酶基因ftsW。

在一种实施方式中，所述第一必需基因调控模块包括：启动子P_veg105、RBS₁、第一必需基因和阻遏蛋白lac I表达框。

在一种实施方式中，所述第二必需基因调控模块包括：启动子P_veg105、RBS₀、N端编码序列N₁、第二必需基因、IPTG诱导型启动子P_grac2、转录调控蛋白nanR的编码基因。

在一种实施方式中，所述第一必需基因是二氢蝶呤醛缩酶基因folB，所述第二必需基因是SEDS家族肽聚糖糖基转移酶基因ftsW。