[发明专利]一种肝脏纤维化疾病模型的构建方法和应用

说明书

本发明提供了一种肝脏纤维化疾病模型的构建方法和应用。本发明方法通过敲除目标动物肝脏实质细胞中的基因组中的NF‑YA基因序列，使目标动物表现出典型的肝脏纤维化疾病特征。该目标动物既可作为肝脏纤维化疾病模型，用于肝脏纤维化疾病的研究，可以帮助阐明肝脏纤维化疾病的发病过程及机制，并为该疾病的治疗或预防提供新的靶标。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种肝脏纤维化疾病模型的构建方法和应用。

背景技术

肝纤维化是大多数慢性肝病的共有的主要特征。临床上常见于病毒性肝炎、酒精肝、脂肪肝、自身免疫性疾病、自身代谢综合征等。其主要特征表现为细胞外基质(Extracellular Matrix)增多，尤其以胶原纤维为主等过度增生。当纤维组织过度增生形成交联的锁链状，破坏了原有的肝小叶结构后，可进一步发展成为肝硬化。当形成肝硬化后其过程便不可逆转，肝脏功能丧失，最终多数患者发展成为原发性肝癌。而肝纤维化作为一种修复机制在发展成肝硬化之前是可以逆转的。因此，找出纤维化发生的刺激因子、以及抗纤维化治疗一直是肝病研究和防治的重要方向。

为了更好地研究和治疗肝脏纤维化，以及筛选出可有效治疗肝脏纤维化的药物，本领域需要能够模拟出肝脏纤维化特征的动物模型。

目前，对肝脏纤维化疾病模型的构建主要包括以下几类：

化学损伤肝纤维化模型的建立目前最广泛应用的是利用四氯化碳(CCl₄)建立肝纤维化模型，利用四氯化碳直接溶解肝细胞膜，经干细胞细胞色素p450依赖性混合功能氧化酶的代谢，生成活性的三氯甲基自由基和氯甲基自由基，启动脂质过氧化作用，导致肝细胞损伤。但是，单独使用CCl₄诱导肝纤维化模型虽然简单易行，但死亡率较高(NabeshimaY,Tazuma S,Kanno K,et al.Anti-fibrogenic function of angiotensin II type 2receptor in CCl₄-induced liver fibrosis.[J].Biochem Biophys Res Commun，2006，346(3)：658-664)。此外，还有利用二甲基亚硝胺(DMNA)、D-氨基半乳糖(DGA)、二乙基亚硝胺(DEN)、硫代乙酰胺(TAA)等物质诱导肝纤维化的报道，但由于DMNA、DEN是致癌药物，TAA毒性大，DGA价格昂贵、造模时间长等缺点，均很难推广应用。

酒精性肝纤维化动物模型则是利用了肝脏是酒精代谢、降解的主要场所的特点，过度饮酒使自由基产生、脂肪积蓄、脂质过氧化对肝细胞造成损伤诱导肝纤维化。但实际造模过程中由于动物厌酒，难以控制摄入量等问题，也难以推广应用。

营养性肝纤维化动物模型主要通过膳食不平衡或缺乏特种营养素引起干细胞脂肪变性，进而形成肝纤维化，但耗时长、饲料配制复杂且花费大。

复合损伤肝纤维化模型建立目前主要是上述方法的结合，通过采用高脂低蛋白食物、饮用酒精，以及皮下注射CCl₄的方式，诱导但肝纤维化，能够获得较高的成型率，但是死亡率仍能达到20％左右。

可见，目前构造肝纤维化疾病模型的方法均存在诸多缺陷，需要较长的建模时间，而且建模成型率、死亡率的不可控因素较强。因此，进一步研究建模成型率高、耗时短、死亡率低的肝纤维化疾病模型的构建方法，将为深入全面地研究肝纤维化发病机制，为临床筛选防治肝纤维化药物提供研究基础。

发明内容

本发明的目的在于提供一种肝脏纤维化疾病模型的构建方法。本发明的发明人首次发现，在目标动物的肝脏实质细胞中敲除NF-YA基因即沉默NF-YA基因的表达，可以使得目标动物表现出肝脏纤维化疾病相关的特征例如肝脏表面有明显的纹理分膈、纤维增生、肝叶边缘锐化、肝小叶界板破坏明显、形成假小叶。因此，肝脏实质细胞中的NF-YA基因被敲除的动物可以作为肝脏纤维化疾病模型，用于肝脏纤维化疾病研究等领域中，为该疾病的研究例如发病过程、机制以及相关药物的筛选提供一种新的模型。