[发明专利]一种不含PH缓冲液的兼容各种磁珠法病毒核酸提取试剂盒的灭活型病毒保存液

说明书

本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种不含PH缓冲液高度兼容磁珠法病毒核酸提取试剂盒的病毒保存液，其包含以下成分：盐酸胍，十二烷基硫酸锂，硫酸铵，曲拉通X‑100等蛋白变性剂和核酸保护成分，可以迅速灭活病毒以及DNA和RNA酶类，既具有裂解病毒样本的作用，同时也可以保护DNA和RNA的稳定性。本发明病毒保存液的不需要加入三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐、乙二胺四乙酸等PH缓冲液以及、异丙醇或乙醇等可能造成成分，不会对后续的提取造成干扰，能够与市场上常见的各类磁珠法病毒核酸提取试剂盒兼容，提取核酸时，样本与裂解液可以按试剂盒建议的比例至100％之间的任意比例混合，即可以少加甚至不加裂解液，进而提高样本的用量，获得更多的病毒核酸和更准确的检测结果。

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，尤其是指一种兼容各种病毒核酸提取试剂盒的灭活型病毒保存液。

背景技术

呼吸道感染(Respiratory tract infection, RTI)是人类最常见的一类疾病，是全球范围内引起人群发病和死亡的最主要原因之一。目前已证明，大部分呼吸道疾病是病毒引起。病毒性感染的潜在危害极大，例如新型冠状病毒(SARS-CoV-2)，该病毒是一种先前未在人类中发现的新型冠状病毒，可导致急性感染性肺炎(COVID-19)，感染者初始症状多为发热、乏力和干咳。后续逐渐出现呼吸困难，严重者可出现急性呼吸窘迫综合征或脓毒症休克，甚至死亡。

病毒性感染的金标准是实时荧光定量PCR，是一种用于指数扩增特定的核酸片段并用荧光信号来判断待检测的靶标是否存在的分子诊断方法，其最大特点，是能将微量的核酸进行大量的富集和增加，从而达到便于检测微量核酸的目的。

实时荧光定量PCR需要提取疑似样本中的核酸(DNA、RNA)来检测是否存在致病病毒。而受到时间或距离的限制，一般需要将待测样本保存一段时间，或送至特定的地点才能进行检测。

目前市场上已有病毒保存液可以满足以上需求，比如Hank’s液、PBS溶液，但是也存在一些缺陷：1)需要低温保存，大大增加了样本的运输成本，如果操作不当，运输过程中无法达到所需低温条件，样本的核酸可能会降解。而为了灭活病毒，需要55°C处理一段时间，这样病毒RNA可能会大量降解，可能导致荧光定量PCR呈假阴性，影响病情的判断。2)无法快速灭活病毒，这样会对操作人员造成安全隐患。快速经约3mL保存液稀释后。

目前主流磁珠法病毒核酸提取试剂盒都是蛋白酶K加裂解液，如易迈吉生物、诺维赞生物、海狸生物、之江生物、硕世生物等。在高浓度离子化剂和乙醇/异丙醇核酸沉淀剂的条件下，硅基磁性粒子可通过氢键和静电吸附核酸，吸附了核酸的纳米粒子经洗涤去除蛋白质和盐，最后可以用低盐缓冲液(如Buffer TE)或水洗脱出磁珠上的核酸。其中，硅基磁性粒子吸附核酸是影响最终核酸提取效率最为关键的一步，这一步中，加热温度，涡旋震荡幅度，PH值，乙醇/异丙醇的比例是关键参数，每家试剂盒的最优参数都是不一样的。任何干扰这些参数的因素都会影响试剂盒提取的效率甚至导致提取失败。市场上已有的灭活型病毒核酸保存液一般含有含有PH缓冲液或者乙醇/异丙醇成分，这样造成病毒保存液与病毒核酸提取试剂盒兼容性差，一种病毒保存液只能与特定的几家病毒核酸提取试剂盒兼容，无法兼容市面上已有的大部分病毒核酸提取试剂盒。因此，开发一种能快速释放核酸、不易造成交叉污染并且对后续核酸检测实验无影响的核酸快速释放方法成为目前亟待解决的问题。

发明内容

基于此，本发明的目的是提供一种具有保存和裂解能力、可以室温保存及运输、能与各类病毒核酸提取试剂盒兼容、安全性高的病毒保存液。

本发明的灭活型病毒保存液的方法按照以下步骤进行：

1. 将不同类型的样本与灭活型病毒保存液按照一定比列，涡旋振荡：

2. 拭子类样本(咽拭子/鼻拭子/肛拭子):将采样后的拭子头折断浸没于含有灭活型病毒保存液的采样管中，旋紧管盖；

3. 人工合成的假病毒，体外转录RNA样本: 取适量样品，稀释到一定体积的Buffer PBS/灭活型病毒保存液,振荡混匀；