[发明专利]用于高效外源蛋白表达和高密度培养的工程枯草芽孢杆菌

权利要求书

1.一种用于高效外源蛋白表达和高密度培养的重组枯草芽孢杆菌的构建方法，其特征在于：通过基因工程方法在组氨酸缺陷型枯草芽孢杆菌胞内表达由hisC基因编码的组氨醇磷酸氨基转移酶；其中，所述枯草芽孢杆菌选自：组氨酸缺陷型菌株SCK6，其芽孢杆菌遗传保藏中心（Bacillus Genetic Stock Center，BGSC）的保藏编号为1A976；所述hisC基因编码的氨基酸序列如NCBI-Protein ID：NP_390143所示。

2.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述基因工程方法是通过在所述枯草芽孢杆菌导入游离质粒表达，和/或在其基因组上原位突变，和/或在其基因组上引入单个或多个拷贝的具有功能的hisC基因。

3.如权利要求1至2任一项所述的构建方法，其特征在于，进一步对所述枯草芽孢杆菌中的基因spoIIAC和/或srfAC进行失活、敲除、或者降低其表达。

4.如权利要求3所述的构建方法，其特征在于，构建所述重组枯草芽孢杆菌时首先失活、敲除其基因upp以获得能够进行高效无痕遗传操作的复筛选标记。

5.如权利要求1至4任一项所述的构建方法获得的重组枯草芽孢杆菌。

6.如权利要求5所述的重组枯草芽孢杆菌在表达外源基因中的应用。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述外源基因编码的是葡聚糖磷酸化酶，葡萄糖磷酸变位酶，磷酸葡萄糖异构酶，塔格糖6-磷酸4-差向异构酶，塔格糖6-磷酸磷酸酶，磷酸葡萄糖/磷酸甘露糖异构酶，甘露糖6-磷酸磷酸酶，异淀粉酶，葡萄糖苷转移酶、葡萄糖激酶，α-淀粉酶，葡萄糖异构酶，L-阿拉伯糖异构酶，D-阿洛酮糖6-磷酸3-差向异构酶，D-阿洛酮糖6-磷酸磷酸酶中的一种或多种，通过基因工程方法将所述外源基因导入所述重组枯草芽孢杆菌中。

8.如权利要求6或7所述的应用，其特征在于，其是通过发酵所述重组枯草芽孢杆菌以表达所述外源基因，其中所述发酵培养基中采用无机氮源。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述发酵培养基含有如下组分：酵母抽提物、硫酸镁、硫酸锰、磷酸二氢钾、微量元素、氯化钙，维生素B1，氯化铵和葡萄糖。

10. 如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的发酵培养基组成如下：酵母抽提物0.1-10 g/L、硫酸镁0.1-10 g/L、硫酸锰0.1-10 g/L、磷酸二氢钾0.1-10 g/L、微量元素0.1-10 mL/L、氯化钙0.1-10 g/L，维生素B1 0.1-10 g/L，氯化铵0.1-50 g/L和葡萄糖0.1-50g/L。

11.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述发酵的过程中采用磷酸或柠檬酸和氨水控制pH为5.0-8.5，发酵温度为18℃-45℃。

12.如权利要求11所述的应用，其特征在于，所述发酵过程中采用磷酸或柠檬酸和氨水控制pH为7.0，发酵温度为37℃。