[发明专利]一种负载热休克蛋白的异体mRNA-DC肿瘤疫苗及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种负载热休克蛋白的异体mRNA‑DC肿瘤疫苗及其制备方法和应用。该多肽疫苗包括热休克蛋白以及与其复合的抗原肽；其制备方法为：(1)诱导树突状细胞分化，并将异体来源的骨肉瘤细胞mRNA转染至该树突状细胞中，制备得到异体mRNA‑DC瘤苗细胞；(2)利用免疫沉淀技术从异体mRNA‑DC瘤苗细胞中分离得到该HSP‑多肽疫苗。本发明通过对抗原肽组成成分进行优化，能够根本上提高HSP.PC的免疫原性，以弥补肿瘤细胞来源的HSP.PC“免疫原性不够强”的缺点。

技术领域

本发明属于生物制药技术领域，具体涉及一种负载热休克蛋白的异体mRNA-DC肿瘤疫苗及其制备方法和应用。

背景技术

肿瘤的免疫治疗机制主要是通过调节或增强机体本身固有的内在性防御机制(主要是机体对肿瘤细胞的免疫监视和免疫排斥)来抑制或杀伤肿瘤细胞，或通过抑制肿瘤细胞转化，促进恶性细胞分化来降低肿瘤的恶性程度。肿瘤疫苗(简称“瘤苗”)的制备，是肿瘤免疫治疗的重要手段之一，而各种肿瘤疫苗中伴侣分子抗原肽瘤苗则是当前的研究热点，其原理是通过激活患者自身的免疫系统，利用肿瘤抗原肽诱导机体的非特异性抗肿瘤机制及特异性细胞免疫和体液免疫反应，增强机体的抗癌能力，阻止肿瘤生长、扩散和复发，达到清除或控制肿瘤的目的。

热休克蛋白(heat shock proteins,HSP)是细胞受到应激刺激包括受热、惊厥、癫痫、缺血、缺氧等后诱导染色体HSP基因的表达而合成的蛋白质。HSP作为体内最重要的分子伴侣之一，主要负责新生肽段及蛋白质的折叠、展开及在不同细胞腔隙中的转运，在抗原处理、加工、呈递发挥关键作用，在DC细胞表面上亦有其高亲和力受体(主要是CD91)。HSP是生物体内普遍存在，进化上高度保守的蛋白质，Morimoto等按其分子量可分为以下几个家族：HSP110、HSP 90、HSP70、HSP60、小分子量HSP(相对分子量为22232kD)及泛素(相对分子质量为728kD)，它们除了具有重要的分子伴侣功能外，还参与细胞抗损伤、分化等。其中HSP70家族成员最多，共有21种蛋白质，功能最为重要，特别是其在抗肿瘤的免疫效应中发挥着关键性作用，能够将与其结合的抗原多肽通过内源性途径传递给MHC I类分子，引发特异性的T细胞反应，该领域已成为目前的研究热点之一。

在肿瘤细胞中，肿瘤抗原蛋白经蛋白酶水解成丰富的肿瘤抗原肽段后，与HSP70形成抗原肽复合物HSP.PC，然后通过抗原处理相关转运蛋白(transporters associatedwith antigen processing,TAP)将抗原肽运输至内质网并与MHCI类分子进一步结合，最终将抗原肽呈递于细胞表面。因此，HSP.PC也被誉为肿瘤细胞抗原肽的指纹。HSP.PC被提取或释放出肿瘤细胞后，与抗原呈递细胞(antigen presenting cell,APC)的膜受体结合进入细胞内，被胞质中的蛋白酶体降解成肽段，经TAP途径将抗原肽转运到内质网腔内，与MHC分子形成复合体转入高尔基复合体内，再通过分泌泡转运到细胞表面，激活肿瘤抗原特异性的适应性免疫反应(CD8及CD4淋巴细胞反应)，以及非特异性的固有免疫反应(细胞因子释放，自然杀伤细胞(natural killer cells,NK)细胞活化，促DC成熟)，最终诱导有效的抗肿瘤免疫效应。

但现有的HSP.PC存在免疫原性不够强的缺点：主要表现为在早期肿瘤患者有效，在晚期患者中无显著抗瘤效应。2008年，权威杂志lancet报道了全球最大的(728例患者)III期临床试验，结果表明：在早期患者中，HSP.PC治疗组与对照组无统计学差异。同年Testori A等人报道了另一起大规模3期临床试验(322例患者)，其结果与lancet报道一致，HSP.PC治疗仅对早期肿瘤患者有效。②HSP.PC疫苗获得量有限：HSP.PC获得量是受患者来源的肿瘤组织及细胞数量而限制的，很多患者无法获得要求的最低治疗剂量(最低免疫次数4次)。Testori A等进行的III期临床试验表明仅有49％的患者分离到了最低需要的治疗剂量。