[发明专利]重组腺相关病毒、其突变体及其构建方法和应用

说明书

本发明公开了重组腺相关病毒、其突变体及其构建方法和应用。本发明首先提供了包含rep cassette、cap cassette和ITRs cassette的重组腺相关病毒载体。本发明进一步将腺相关病毒的rep cassette进行单位点突变、双位点突变或多位点突变得到包装效率显著提高的系列突变体。本发明进一步提供了包含所述rep cassette的突变体的重组腺相关病毒载体以及构建方法。本发明所提供的重组腺相关病毒表达效率高，用这种病毒粒子向细胞中呈递基因比传统的病毒粒子更高，能够将目的基因高效呈递至细胞和脊椎动物体内，可作为基因呈递载体用于制备基因治疗药物。

技术领域

本发明涉及腺相关病毒，尤其涉及重组腺相关病毒、突变体及其构建方法，本发明进一步涉及它们在基因治疗中的应用，属于重组腺相关病毒及其应用领域。

背景技术

腺相关病毒是一种单链DNA病毒，属于细小病毒家族的依赖病毒属。1965年作为腺病毒制备物中的一种污染成分首次被发现。作为一种缺陷型病毒，通常需要腺病毒或单纯疱疹病毒等才产生毒性感染，在可在哺乳动物细胞中长期潜伏感染。

野生型AAV可以被改造成为重组载体，并能够携带外源基因，只需将病毒基因组两端的ITRs 保留，rep和cap可以被外源基因所替代，通过其它方法携带rep和cap基因，从而反式提供这两种蛋白的功能，目前包装rAAV的方式主要有三种，质粒转染、构建稳定的细胞系和通过杆状病毒表达系统来包装。杆状病毒表达系统因其启动子可以对表达的蛋白进行加工修饰、且能够扩大生产规模，很早就被用来进行rAAV的生产，被EMA批准进入欧洲市场的Glybera就是用该系统生产的，常用AcNPV表达系统和BmNPV表达系统。早在几十年前，BEVS已被用于工业中大量生产重组蛋白，是一种较为经济可行的平台，可以用于生产rAAV病毒颗粒。即便如此，上述 AcNPV-sf9细胞表达系统由于细胞培养的成本偏高，而导致病毒载体制备的价格昂贵。第一个商品化的AAV产品Glybera，它的单次治愈剂量的标价最初高达160万美元；美国获批的AAV产品Luxturna的销售定价为85万美元。所以生产成本是限制AAV作为基因治疗载体的关键因素之一。从生产成本看，据报道，仅用5个蚕蛹的外源蛋白的表达量相当于1升昆虫细胞的表达量，在家蚕幼虫的血淋巴中各类基因的表达量分别是sf细胞表达量的几十甚至上百倍。生产成本比细胞低几百倍，而且昆虫细胞培养的成本远远高于家蚕饲养成本。从安全性来看，家蚕作为鳞翅目昆虫，已经列入食品目录，僵蚕作为我国传统的名贵中药，已经被列入卫生部中药名录，这些都表明用家蚕杆状病毒表达系统生产rAAV的安全性是有保证的，且已成功利用三杆状病毒表达系统包装出rAAV，经过验证，具有感染哺乳动物并驱动目的基因表达的能力，不仅具有AcNPV-sf 系统的优点，而且表达量更高，生产成本低几百倍，所以BmNPV-家蚕杆状病毒表达系统是一个潜力巨大的rAAV生产系统，其安全性和生产成本较低使其成为比较理想的rAAV生产系统，但其后续产品纯化技术还需进一步摸索，应用家蚕杆状病毒表达系统生产rAAV为解决目前因生产成本过高而限制AAV载体在基因治疗中应用的问题提供一种新思路，构建各型AAV的生产平台，能快速、高效地生产含各种目的基因的rAAV，这对rAAV更好的应用于基因治疗具有十分重要的意义。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种包含rep cassette、cap cassette或ITRscassette的重组腺相关病毒载体；

本发明的目的之二是将腺相关病毒的rep cassette进行单位点突变、双位点突变或多位点突变得到包装效率显著提高的重组腺相关病毒系列突变体；

本发明的目的之三提供包含所述rep cassette的突变体的重组腺相关病毒载体；

本发明的目的之四是提供所述重组腺相关病毒载体的构建方法；

本发明的目的之五是将所述重组腺相关病毒载体作为基因呈递载体应用于制备基因治疗药物。

为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案包括：