[发明专利]一种淀粉普鲁兰酶突变体及其应用

说明书

本发明公开一种淀粉普鲁兰酶突变体及其应用，其获得的方法是以来源于古细菌Staphylothermus marinus F1的淀粉普鲁兰酶SmApu亲本酶，将位于第395位的苯丙氨酸或者位于第510位的苯丙氨酸进行突变得到的淀粉普鲁兰酶突变体。本发明的淀粉普鲁兰酶突变体具有水解支链淀粉中的α‑1，6‑糖苷键的活性的同时，完全丧失了水解环糊精活性，在淀粉、环糊精葡萄糖基转移酶的高温反应体系中，加入本发明的淀粉普鲁兰酶突变体，可以使环糊精的总产率提高43％以上。

技术领域

本发明涉及一种淀粉普鲁兰酶(amylopullulanase,Apu)突变体及其应用，属于基因工程和酶工程领域。

背景技术

环糊精是一系列以α-1,4-糖苷键相连的、环状葡聚糖的总称，以含有6、7、8个葡萄糖单元的α-、β-和γ-环糊精为最常见。由于环糊精的外缘亲水而内腔疏水，所以它能作为主体包络各种适当的客体，形成复合物，从而广泛应用于食品、医药、化工、环保等领域。

环糊精葡萄糖基转移酶(cyclomaltodextrin glucanotransferase,CGTase)能够催化淀粉中的直链淀粉水解环化、合成环糊精。然而，普通淀粉仅含有20-25％的直链淀粉，大部分为75-80％的支链淀粉。支链淀粉是多个α-1,4-葡萄糖残基组成的线性链被多个α-1,6-糖苷键连接而成的分支多糖。由于环糊精葡萄糖基转移酶不能水解α-1,6-糖苷键，所以淀粉转化为环糊精的产率较低。普鲁兰酶能水解支链淀粉中的α-1,6-糖苷键、脱除支链而产生线性麦芽糊精，所以在生产环糊精的过程中需要同时添加环糊精葡萄糖基转移酶和普鲁兰酶，进而提高环糊精的产率。

在工业生产中，传统的环糊精的生产方法为先将淀粉乳加热至90℃以上的高温进行糊化液化，然后降低温度至30-45℃、再加入普鲁兰酶和环糊精葡萄糖基转移酶。这种工艺需要额外增加降温步骤，而且在中等温度下合成环糊精也容易被微生物污染，影响环糊精的产率。随着基因工程和酶工程技术的发展，已经筛选出具有85℃以上的最适催化反应温度的超嗜热环糊精葡萄糖基转移酶和超嗜热淀粉普鲁兰酶，这样，淀粉乳经高温糊化后，不需要降温，就可以直接加入超嗜热环糊精葡萄糖基转移酶和超嗜热淀粉普鲁兰酶进行高温催化。这种工艺不但减少了降温步骤，而且由于在较高的温度下进行催化反应，也不会被微生物污染。但是，现有技术中大多数超嗜热淀粉普鲁兰酶的活性低、专一性差等缺点，影响了环糊精的产率。

来源于古细菌Staphylothermus marinus F1的淀粉普鲁兰酶SmApu，具有105℃的最适催化反应温度，并且在85-90℃保温3小时，仍能保留90％以上的原始酶活，是目前为止热稳定性最高的超嗜热淀粉普鲁兰酶。它能够在高温催化支链淀粉的脱支反应，直接将普通谷物淀粉转化为线性麦芽糊精。但是，淀粉普鲁兰酶SmApu除了具有催化淀粉脱支的活性，还具有将环糊精水解为葡萄糖和麦芽糖的活性。因此，为提高环糊精的产率，降低淀粉普鲁兰酶SmApu对环糊精的水解作用是亟待解决的问题。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种淀粉普鲁兰酶突变体及其在制备环糊精中的应用，通过定点突变的方法，使来源于古细菌Staphylothermus marinus F1的淀粉普鲁兰酶SmApu不具备环糊精水解活性，提高环糊精的产率。

本发明的第一个目的是提供一种淀粉普鲁兰酶突变体，所述淀粉普鲁兰酶突变体是以如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的野生型古细菌Staphylothermus marinus F1淀粉普鲁兰酶SmApu为基础，将位于第395位的苯丙氨酸或者位于第510位的苯丙氨酸进行突变得到的。

作为本发明的优选，所述突变体是将第395位的苯丙氨酸突变为丙氨酸，命名为SmApu-F395A，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

作为本发明的优选，所述突变体是将所述第510位的苯丙氨酸突变为丙氨酸，命名为SmApu-F510A，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。