[发明专利]一种高病毒产量乙型肝炎病毒表达载体的构建及应用

说明书

本发明涉及一种高病毒产量乙型肝炎病毒表达载体，该载体使用外源CMV启动子来启动乙型肝炎病毒pgRNA的转录，使用外源牛生长激素多腺苷酸化信号终止转录。本发明还涉及该载体的构建方法以及应用。本发明改造后的HBV表达载体，同初始HBV表达载体相比，其病毒表达水平得到了很大提升，产生的病毒颗粒量提高了约25倍，可以有效的体外感染细胞，从而可以用来研究不同HBV病毒株生活史早期感染阶段特征，以及开发和评价靶向HBV生活史早期感染阶段的药物。

技术领域

本发明属于病毒分子生物学领域，涉及一种高病毒产量乙型肝炎病毒表达载体的构建及应用。

背景技术

HBV基因组为松弛环状的双链DNA（rcDNA），长度约3.2 kb。目前已知HBV基因组序列有较高的多样性。根据HBV全基因组核苷酸序列异源性≥8%，可将HBV分为10个基因型（A-J）。这些基因型又可进一步细分为许多具有特定地理分布的亚基因型。除此之外，临床上还发现了大量各种变异的病毒株，包括免疫逃逸株、耐药突变株等。临床相关性研究表明不同序列的HBV病毒株在疾病进展、自然史和对治疗的应答方面均有所不同，因此研究不同HBV病毒株的病毒特征差异对于预防、诊断或治疗HBV非常必要。

研究不同HBV病毒株的病毒特征，主要是通过分子克隆的方法将病毒基因组构建到表达载体中，然后在体外细胞模型上进行深入研究。通过简单的瞬时转染的方法可将HBV表达载体运送到肝癌细胞系的细胞核中，然后HBV表达载体可以模拟HBV cccDNA的功能，转录出所有类型的病毒RNA。病毒RNA被转录后，后续的翻译、包装、病毒DNA合成和病毒颗粒释放同真正的病毒复制过程基本一致。因此该瞬时转染方法可以模拟HBV生活周期的后期复制阶段，被广泛用来研究病毒生活周期的后期复制阶段特征，以及不同病毒株对临床应用的病毒聚合酶抑制剂敏感性的影响，对我们了解和治疗HBV发挥了巨大作用。但是该方法不能模拟HBV生活史早期感染阶段（从结合肝细胞表面受体开始，到进入细胞，再被运送到细胞核形成cccDNA），因此不能用来筛选靶向HBV早期感染阶段的药物和评价不同病毒株对治疗方法的敏感性，例如用该模型无法测定不同病毒株对HBV免疫球蛋白的应答。

为了研究不同HBV病毒株生活史早期感染阶段的特征和评价它们对靶向该阶段的药物敏感性，需要制备不同基因序列的病毒颗粒来进行体外感染细胞实验。目前能用来进行体外细胞感染实验的病毒颗粒几乎全部来源于两个稳定表达HBV的细胞系HepG2.2.15和HepAD38，但是这两个细胞系只能提供单一的D型HBV病毒颗粒（在我国主要流行的是B型和C型）。只有瞬时转染的方法才可以很方便的产生各种不同基因组序列的病毒颗粒，只需将含不同HBV病毒株基因组的表达载体转染到肝癌细胞系中即可，但是该方法产生的病毒颗粒滴度较低，无法有效的感染细胞。该难题严重影响了我们对HBV生活史早期感染阶段的研究，以及开发和评价靶向HBV早期感染阶段的药物。

要解决体外细胞感染实验中HBV病毒颗粒来源难题，就需要优化现有的HBV表达载体，提高病毒表达水平，从而增加释放的病毒颗粒滴度。目前最常用的HBV表达载体是包含1.3倍HBV基因组的质粒，该载体使用HBV自身的增强子和启动子来启动病毒各个基因的转录，同时使用自身的多聚腺苷酸信号位点来终止转录。使用含1.3倍HBV基因组的质粒来表达HBV病毒，其病毒产量很难满足体外感染实验的需要。因此，需要对载体做进一步的改进。

发明内容

本发明的第一目的是提供一种高病毒产量乙型肝炎病毒表达载体，克服现有的乙型肝炎病毒表达载体病毒产量低，不能满足体外细胞感染实验需要的问题。

本发明的第二目的是提供上述高病毒产量乙型肝炎病毒表达载体的构建方法。

本发明的第三目的是提供上述高病毒产量乙型肝炎病毒表达载体的应用。

本发明通过以下技术方案来实现：

一、一种高病毒产量乙型肝炎病毒表达载体，该载体使用外源CMV启动子来启动乙型肝炎病毒pgRNA的转录，使用外源牛生长激素多腺苷酸化信号终止转录。