[发明专利]一种肺癌肝转移早期诊断试剂盒及制备使用方法

权利要求书

1.一种肺癌肝转移早期诊断试剂盒，其特征在于，包括：抗体预包被酶标板、ELA2-DNA标准品、样品稀释液、Anti-DNA-POD抗体、ABTS溶液、ABTS终止溶液和洗涤液，其中，所述抗体预包被酶标板由纯化抗人ELA2抗体包被制成；所述ELA2-DNA标准品是多个肺癌肝转移患者的混合血清；所述样品稀释液包括磷酸盐缓冲液和调节酸碱度的盐酸；所述洗涤液为PBST溶液。

2.根据权利要求1所述的肺癌肝转移早期诊断试剂盒，其特征在于，所述样品稀释液具体包括：NaC1、KCl、Na₂HPO₄和KH₂PO₄、HCl和双蒸水。

3.根据权利要求1所述的肺癌肝转移早期诊断试剂盒，其特征在于，所述ABTS溶液具体包括：ABTS二胺盐溶液和二硫酸钾溶液；所述ABTS终止溶液具体包括：十二烷基硫酸钠和去离子水；所述PBST溶液为含0.05％Tween20的1×磷酸盐缓冲液。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的肺癌肝转移早期诊断试剂盒，其特征在于，所述预包被酶标板为96孔聚苯乙烯透明微孔板。

5.一种肺癌肝转移早期诊断试剂盒的制备方法，其特征在于，包括：

纯化抗人ELA2抗体用0.01mol/L pH 9.5的碳酸盐缓冲液稀释成5μg/ml，按每孔100μl的量包被ELISA微孔板，4℃过夜；

包被步骤完成后，去除ELISA微孔板内的包被液，按每孔160μl的量加入1％BSA封闭液，4℃封闭过夜；

封闭步骤完成后，去除所述ELISA微孔板内的封闭液后制成抗体预包被酶标板；

收集肺癌肝转移患者血液样本，在4℃温度条件下以3000rmp的速率离心10min，取上清，制成血清样本；

将所述血清样本进行5倍稀释，制成稀释样本；

清洗所述预包被酶标板，每孔加入100μl所述稀释样本，设置阴性孔，封板后在25℃温度条件下，以250rmp的速率震荡，孵育120min；

孵育完成后洗板并拍干；

将Anti-DNA-POD抗体用样品稀释液20倍稀释，加入反应孔，每孔100μl，封板后在25℃温度条件下，以300rmp的速率震荡，孵育120min；

反应完成后洗板并拍干；

每孔加入100μlABTS溶液，设置空白孔，封板后在25℃温度条件下，以250rmp的速率震荡，孵育20～30min；

待显色均匀，在每孔加入100μl ABTS终止溶液终止反应，并于405nm处测定OD值；

根据ELA2-DNA含量数值，将多个肺癌肝转移患者的血清混合；

另取一酶标板，将纯化的1μg/ml的小牛胸腺DNA作为检测混合血清样本中游离DNA的标准品，使用TE缓冲液稀释1μg/ml小牛胸腺DNA，调整体积为50μl加入酶标板，再向每孔加入50μl的2×PicaGreen试剂，使终体系为100μl；

使用TE缓冲液将混合的血清样本分别做0倍稀释、5倍稀释、25倍稀释，向酶标板中每孔加入50μl的混合血清样本，再向每孔加入50μl的2×PicaGreen试剂，使终体系为100μl；

避光于室温下放置2min～5min，使用多功能酶标仪选择蓝色激发光，检测样品中游离DNA含量；

对小牛胸腺DNA浓度与OD值进行一元一次方程回归拟合标准曲线，回归方程的相关系数R²＞0.9500；将混合血清样本的OD值代入标准曲线计算出混合血清样本中的游离DNA浓度，并调整为200ng/ml，制成ELA2-DNA标准品。

6.根据权利要求5所述的肺癌肝转移早期诊断试剂盒的制备方法，其特征在于，还包括：

称取8g NaC1、0.2g KCl、1.44g Na₂HPO₄和0.24g KH₂PO₄，溶于900ml双蒸水中，用盐酸调pH值至7.4，加水定容至1L，121℃、0.1MPa高压灭菌20min后，制成样品稀释液，室温贮藏备用。