[发明专利]以修饰的MSC培养记忆型T细胞的方法

说明书

一种以修饰的MSC培养记忆型T细胞的方法，其中修饰的MSC表达IL‑15和IL‑7；为了提高活性对IL15进行了突变；此外还提供了使用前述MSC制备的细胞培养瓶。

技术领域

本申请属于细胞培养技术领域，具体地，本申请提供了以修饰的MSC培养记忆型T细胞细胞的方法，其中修饰的MSC表达IL-15和IL-7。

背景技术

记忆型T细胞(Tcm)是幼稚T细胞经过抗原激活后，产生的具有长期记忆性的，并能够归巢到淋巴结接受抗原再刺激的T细胞，在抗原的再次刺激之下，可继续产生大量的携带同种抗原的克隆化的效应记忆型T细胞(Tem)细胞。记忆型T细胞的生物标记为CD62L和CD45ROa双阳性的细胞，这代表了记忆型T细胞能够通过淋巴屏蔽，回归淋巴结，同时处于被抗原激活的状态。

记忆型T细胞细胞抗肿瘤具有以下特点：第一，由于其表达CD62L+，在淋巴结更易接受APC递呈的抗原信息而二次活化；第二，记忆型T细胞回输到体内可被肿瘤抗原在激活起到直接杀伤肿瘤的作用；第三，记忆型T细胞细胞具有自我更新及复制能力，在体内存活时间长，可起到长期抗肿瘤作用；第四，在体外能够高效率扩增保证T细胞的回输数量。

目前已知的记忆型T细胞制备方法是从外周血中分离原代初始型T细胞，先利用CD3单克隆抗体和IL-2进行活化。活化24小时后，加入包括IL-7、IL-15和IL-21的培养基进行培养。培养至6-9天后收获细胞。由于记忆型T细胞细胞亚群的增殖特点，在体外培养中，随着培养时间的延长，记忆型T细胞细胞亚群的比例会迅速降低。因此，短期培养工艺无法保证获得足够数量的目的细胞，而增加初始种子细胞的培养数量，又会使制备成本急剧增加。因此，如何利用经济高效的方法获得记忆型T细胞是目前需要解决的一个技术难题。

发明内容

针对以上问题，申请人发展了一种以修饰的MSC培养记忆型T细胞的方法，其中修饰的MSC表达IL-15和IL-7；为了提高活性对IL15进行了突变；此外还提供了使用前述MSC制备的细胞培养瓶。

一方面，本申请提供了一种修饰的MSC细胞，其特征在于，所述MSC细胞表达IL-15和IL-7。

进一步地，所述IL-15和IL-7的蛋白序列分别为SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.3以及SEQ ID NO.5或其变体。

进一步地，所述MSC中IL-15和IL-7的融合基因序列为SEQ ID NO.7。

进一步地，所述MSC为脂肪MSC或脐带MSC。

另一方面，本申请提供了一种细胞培养瓶，其包含前述MSC细胞。

进一步地，所述培养瓶中的MSC细胞被固定形成饲养层。

进一步地，使用无水乙醇进行所述固定。

另一方面，本申请提供了使用上述MSC或培养瓶培养记忆型T细胞的方法。

另一方面，本申请提供了制备前述MSC细胞的方法，包括：构建IL-15和IL-7载体；制备慢病毒颗粒；感染MSC细胞。

本申请中MSC细胞的构建过程中使用的分子生物学技术为本领域技术人员熟知的常规技术，本领域技术人员可以从诸如《分子克隆》，萨姆布鲁克，科学出版社等著作中获得，也可以查阅相关文献或使用现有的引物设计、蛋白功能预测等工具软件。

本申请中的IL-15和IL-7序列不限于本申请中列出的种类，本领域技术人员可以从Genbank等网站获得各种不如动物白介素序列并常识将其用于本申请的方法，也可以以蛋白领域的现有知识和功能预测方法/软件从上述序列获得变体序列。所述变体序列与亲本序列享有一定的序列同一性，如70％以上，80％以上，90％以上，95％以上，99％以上，并且具备与亲本序列基本相同的功能。