[发明专利]鉴定靶蛋白染色质结合图谱的快速建库方法

说明书

本发明公开了一种鉴定靶蛋白染色质结合图谱的快速建库方法，其步骤包括：收集样本细胞，将活化的磁珠加入细胞中孵育，将磁珠与一抗进行孵育；二抗与重组融合转座酶预结合；磁珠与预结合的二抗和重组融合转座酶进行孵育磁珠中加入转座酶激活剂以及细胞穿孔剂，孵育；终止转座酶反应，进行文库扩增。本发明显著简化了传统方法的流程，缩短了建库时间，提高了建库效率，损失小，对建库材料要求更低。同时，通过将三条不同浓度的DNA标准品掺入到建库过程中，可以达到对文库中DNA拷贝数精确定量的效果。本方法非常适合用于对少量、珍贵样本或者不同处理状态样本的研究。

技术领域

本发明涉及一种鉴定靶蛋白染色质结合图谱的快速建库方法，属于生物技术领域。

背景技术

染色质免疫共沉淀技术（chromatin immunoprecipitation assay, ChIP）是研究基因表达调控、DNA损伤修复和表观遗传修饰的关键手段，也是人们探索生命进程和细胞病变原因的重要工具。随着高通量测序技术的兴起和发展，染色质免疫共沉淀测序技术（ChIP-seq）成为人们研究DNA结合蛋白在染色质上的结合图谱的高效工具。截至到目前位置，人类DNA元件百科全书计划（encyclopedia of dna elements，ENCODE）和表观基因组学路线图计划（Roadmap Epigenomics Project）已经收纳了超过200种DNA结合蛋白的染色质结合图谱，包括表观遗传修饰及其调控蛋白、转录调控因子、染色质结构调控蛋白等。近年来，越来越多的疾病如白血病、实体瘤和神经退行性疾病等被报道出与DNA结合蛋白的染色质结合图谱改变息息相关，众多靶向药也进入了临床试验阶段。

现有的染色质免疫共沉淀测序技术主要分为三种。一是传统的ChIP-seq，由抗体的靶向富集DNA进行建库测序，该方法具有耗时长（需要3天）、对起始材料要求量大（500-2000万细胞）、成本高、操作复杂、对抗体要求严格等缺陷，一直难以大范围推广。第二种是CUTRUN技术，该技术利用Protein A/G-MNase和抗体识别靶蛋白，将靶蛋白邻近区域的染色质切断游离出来进行回收建库。这种方法背景较重，且灵敏度较低、操作繁琐。另一种方法是中国专利文献CN109400714A-抗体靶向的重组融合蛋白以及其在表观遗传学中的应用公开的CUTTag技术，该技术利用Protein A/G-Tn5转座酶复合物，实现在细胞内原位对靶蛋白结合DNA序列的快速标记和片段化，进而利用基因组DNA进行靶向文库扩增。该方法具有耗时短（约1-2天）、操作简单、对细胞起始量要求较低（100-100万个细胞）、成本低等优势，成为代替传统ChIP-seq的有效手段。但这种技术仍然存在操作时间过长、操作过程损失大等缺陷，限制了该技术在珍贵样本和单细胞上的发展和应用。

发明内容

本发明的目的是提供一种适用于低细胞起始量的鉴定靶蛋白染色质结合图谱的可定量快速建库方法，显著简化了传统方法的流程，降低了此类技术对样本的要求。同时，通过将三条不同浓度的DNA标准品掺入到建库过程中，可以达到对文库中DNA拷贝数精确定量的效果。

本发明采用的技术方案为：

一种适用于低细胞起始量的鉴定靶蛋白染色质结合图谱的可定量快速建库方法，其特征在于其步骤包括：

（1）用离心的方式收集样本细胞，将细胞重悬于缓冲液中；

（2）将活化的磁珠加入细胞中孵育，分离收集磁珠；

（3）步骤（2）获得的磁珠与含细胞穿孔剂的一抗进行孵育，分离收集磁珠；

（4）二抗与重组融合转座酶预结合，步骤（3）获得的磁珠与预结合的二抗和重组融合转座酶进行孵育，分离收集磁珠；

（5）步骤（4）获得的磁珠中加入转座酶激活剂，孵育一段时间；

（6）终止转座酶反应；

（7）文库扩增。