[发明专利]检测人血清样本中类固醇含量的方法

说明书

本发明涉及一种检测血清样本中类固醇含量的方法，其包括如下步骤：(1)样本采集：采集静脉血，待血样凝固后，离心得到待测血清样本；(2)蛋白沉降：待测血清样本与含有内标的所述蛋白沉降剂充分混合，涡旋后离心，得到待检测液；(3)采用高效液相色谱串联质谱系统对待检测液进行检测。本发明提供一种前处理简单、快速，检测效率高且成本低的液质联用检测方法，可以同时检测人血清样本中11种类固醇的含量。

技术领域

本发明涉及检测技术领域，主要涉及一种检测人血清样本中类固醇含量的方法。

背景技术

类固醇激素又称甾体激素，是一类四环脂肪烃化合物。人体内源性类固醇激素主要包括肾上腺皮质激素、雌激素、雄激素和孕激素四大类。这些激素在各种酶的作用下相互转化，通过调节各种组织细胞的代谢活动来影响人体的生理活动。激素浓度水平的异常变化与某些疾病的发病机制密切相关，目前临床上已经将类固醇激素水平作为较多疾病的诊断指标，包括先天性类固醇代谢紊乱(如先天性肾上腺增生、先天性发育障碍和先天性盐稳态失调等)和获得性类固醇代谢紊乱(如库欣综合征、艾迪生病、高雄激素血症及精神状态疾病)等。

目前在临床上应用最多的激素检测方法是化学免疫法，近年来气质联用法和液质联用法也在逐渐得到重视和应用。化学免疫法是利用免疫学抗原抗体反应的灵敏性来对待测物进行间接检测。该技术虽然可以自动化操作，检测成本低，但是存在以下弊端：1)由于不同类固醇激素的结构非常相似，通常只是羰基和羟基位置和数量的变化，抗体的特异性不足以进行区分，会导致检测结果的准确性差；2)免疫法的灵敏度相对较差，对于临床的应用有很大的局限性，比如检测女性样本的雄激素水平；3)基质效应强，且不能用内标法进行校正；4)可检测的线性范围有限；5)不同厂家的试剂盒的检测结果以及参考区间差别大；6)一次只能检测一种类固醇激素，效率低。气质联用法是将气相色谱仪与质谱仪联合起来使用的仪器，其特异性和灵敏度较好，但是也存在以下弊端：1)前处理一般都需要复杂的衍生化过程，前处理时间长，且缺乏同时适用于多种类固醇激素的衍生化试剂；2)样本分析时间长，气质联用仪对于单个样本的分析时间一般大于30min，检测通量低。液质联用法是将液相色谱仪与质谱仪联合起来的检测技术，样本中的分析物在液相系统进行分离，然后进入质谱系统，质谱的质量分析器将离子碎片按质量数分开，经检测器得到质谱信号。因此液质联用仪是对待测物直接进行检测，特异性强，并且可以一次检测多种类固醇激素。同时，引入同位素内标进行校准，兼具色谱和质谱的双重分离效果，可以大大降低基质效应，检测准确度高。

公开号为CN111721854A的中国专利申请公开了一种同时检测血清中11项类固醇激素的方法。该方法的前处理过程主要是利用释放剂A和蒸馏水活化固相萃取板，然后将标曲样本、质控样本、待测样本经过固相萃取板，使待测物吸附在固相萃取板的填料上，用15％的甲醇淋洗后，用乙腈进行洗脱，在洗脱液中加入5％的甲醇混匀后进入液质联用仪进行分析。得到样本中皮质素、皮质醇、11-脱氧皮质醇、皮质酮、脱氢表雄酮、雄烯二酮、睾酮、17-羟孕烯醇酮、17-羟孕酮、孕酮、脱氢表雄酮硫酸酯的含量。上述技术前处理利用固相萃取的原理，其中用到的固相萃取板使用前需要经过两步活化，且洗脱前还需要进行淋洗，前处理步骤极其复杂，对技术人员的要求相对较高；固相萃取板的价格昂贵，导致该方法的检测成本比较高；前处理耗时较长，相应的会影响报告周期。