[发明专利]一种Net1基因细胞模型的构建方法与应用

说明书

本发明公开了一种Net1基因细胞模型的构建方法与应用，属于生物技术领域。一种Net1基因细胞模型的构建方法，包括以下步骤：步骤1：培养OC‑1细胞，用siRNA敲减所述OC‑1细胞中的Net1基因，检测敲减效率；步骤2：Lgr5‑EGFP小鼠耳蜗，消化成单细胞后，分选出表达Lgr5细胞，在细胞培养皿中培养；通过siRNA敲除所述表达Lgr5细胞中的Net1基因；步骤3：进行细胞成球试验，观察并量化球形的数量和直径来评估所述表达Lgr5细胞的增殖、分化能力。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种Net1基因细胞模型的构建方法与应用。

背景技术

随着人口老龄化、噪声、病毒感染、耳毒性药物滥用以及环境污染等不良因素的发展和加剧，耳聋及听力障碍人群的数量正逐步上升。耳聋已成为影响社会政治和经济的全球性健康问题，其中感音神经性聋约占耳聋患者的63％。然而，目前临床上尚无疗效确切的内耳靶向性药物可用于治疗感音神经性聋。由于哺乳动物耳蜗毛细胞不可再生，因此如何使毛细胞在损伤后修复和再生，从而在根本上治疗感音神经性聋是近年来听觉领域研究的重点。而提供一种非人类的动物模型作为研究与试验平台以表征毛细胞的修复与再生，同样具有重要的意义。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提出了一种Net1基因细胞模型的构建方法与应用。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

一种Net1基因细胞模型的构建方法，包括以下步骤：

步骤1：培养OC细胞，用siRNA敲减所述OC细胞中的Net1基因，检测敲减效率；

步骤2：Lgr5-EGFP小鼠耳蜗，消化成单细胞后，分选出表达Lgr5细胞，在细胞培养皿中培养；通过siRNA敲除所述表达Lgr5细胞中的Net1基因；

步骤3：进行细胞成球试验，观察并量化球形的数量和直径来评估所述表达Lgr5细胞的增殖能力。

可选地，构建shRNA作为阴性对照，用与GFP结合的无义siRNA评估转染效率。

可选地，用N1603、N1130、N622三种不同的siRNA敲减OC细胞中的Net1基因。

可选地，所述步骤1中培养OC细胞的培养液含有DMEM、10％FBS与氨苄青霉素。

可选地，还包括以下步骤：将所述步骤3中的第一代成球细胞置入培养液中，用EdU染色以及毛细胞标志物抗体标记染色，并结合细胞免疫荧光观察毛细胞分化情况。

可选地，所述毛细胞标志物为myosin7a。

本发明还揭示了上述任一所述的小鼠基因构建方法在研究毛细胞再生的中应用。

本发明的有益效果：

综上所述，通过构建本示例中的细胞模型的方法，能够反映出敲减Net1对毛细胞增殖与分化的影响，因此将该模型作为试验与研究平台，能够有效地促进修复毛细胞的研究。

附图说明

下面结合附图对本发明作进一步的说明。

图1为本申请的细胞模型的基因敲减效率的对比；

图2为本申请的细胞模型敲减Net1前后的的Lgr5细胞的增殖情况对比；

图3为本申请的细胞模型敲减Net1前后的的Lgr5细胞的分化情况对比；

图4为本申请的细胞模型构建方法的流程图。

具体实施方式