[发明专利]基于DNA折纸的二分体脱氧核酶结构及其制备方法和应用

说明书

本发明提供了一种基于DNA折纸的二分体脱氧核酶结构及其制备方法和应用，该制备方法包括：通过退火的方式形成DNA折纸结构；将脱氧核酶的二分体酶链a和酶链b嵌入到DNA折纸结构上；加入帮助链，促使二分体脱氧核酶在DNA折纸结构上成功组装；加入双标记的底物链，通过荧光信号验证二分体脱氧核酶是否有效组装；由于DNA折纸结构限域空间的作用，本发明通过将二分体脱氧核酶嵌入DNA折纸结构上，提高了帮助链和链酶a、链酶b的碰撞几率，同时也降低了杂交的能量势垒，使得二分体脱氧核酶组装在DNA折纸结构上；由于双标记报告底物可以通用，不仅有效降低了对链酶a和链酶b的DNA序列的要求，也降低了多重分析的合成成本。

技术领域

本发明属于生物组装技术领域，具体涉及一种基于DNA折纸的二分体脱氧核酶结构及其制备方法和应用。

背景技术

脱氧核酶是利用体外分子进化技术合成的一种具有催化功能的单链DNA片段，具有高效的催化活性和结构识别能力。目前常用到的脱氧核酶是一条包含了底物结合区和催化核心结构区的DNA单链(如图1所示)，其工作原理是底物链(通常双标记羟基荧光素(FAM)和荧光猝灭集团(BHQ))与脱氧核酶的底物结合区通过碱基互补配对结合，催化核心结构区折叠形成具有催化活性的特定二级结构，催化底物链中RNA碱基水解断裂，释放荧光信号。在实际的应用中，检测不同的底物链，则需要根据底物链的序列重新设计脱氧核酶的底物结合区，更换不同的脱氧核酶。这样不仅增加了合成成本，而且不能实现多种底物链的同时检测。另外，在杂交形成脱氧核酶的过程中，需要克服较高的能垒，所以对序列要求高，不利于广泛应用。

发明内容

针对现有技术中的不足，本发明的首要目的是提供一种基于DNA折纸的二分体脱氧核酶结构的制备方法。即通过将单条脱氧核酶一分为二(酶链a和酶链b)，构建二分体的脱氧核酶(如图2所示)，既可以降低合成成本，又可用于多重分析。二分体的脱氧核酶通常需要与一条额外的DNA序列杂交，从而固定脱氧核酶，使其催化核心结构区能够有效形成。

本发明的另一个目的是提供上述基于DNA折纸的二分体脱氧核酶结构。

本发明的最后一个目的是提供上述基于DNA折纸的二分体脱氧核酶结构的应用。

为达到上述首要目的，本发明的解决方案是：

一种基于DNA折纸的二分体脱氧核酶结构的制备方法，其包括如下步骤：

(1)、通过退火的方式形成DNA折纸结构；

(2)、将脱氧核酶的二分体酶链a和酶链b通过恒温孵育的方式嵌入DNA折纸结构上，并进行电泳纯化，得到纯化后的DNA折纸-酶链a-酶链b结构；

(3)、在纯化后的DNA折纸-酶链a-酶链b结构内加入帮助链，通过恒温孵育的方式，促使二分体脱氧核酶在DNA折纸结构上成功组装，得到基于DNA折纸的二分体脱氧核酶结构；

(4)、加入双标记的底物链，通过荧光信号验证二分体脱氧核酶是否有效组装在DNA折纸结构上。

作为本发明优选的实施例，步骤(1)中，退火的方式为：将骨架链(P7560)和订书钉链按照摩尔比1∶10-1∶5混合，通过退火以1℃/min的速率从95℃降至25℃。

作为本发明的优选实施例，步骤(1)中，DNA折纸结构包括但不限于二维或三维。

作为本发明的优选实施例，步骤(2)中，酶链a中的催化核心碱基序列为GGCTAGCT，酶链b中的催化核心碱基序列为ACAACGA。因此，酶链a和酶链b中包含催化核心15个碱基序列，即GGCTAGCTACAACGA。

作为本发明的优选实施例，步骤(2)中，纯化后的DNA折纸-酶链a-酶链b结构中酶链a和酶链b之间的距离为5nm。