[发明专利]一种乳腺癌模型猪的构建方法及应用

权利要求书

1.一种表达PyMT的猪细胞，其特征在于，将编码PyMT的核苷酸序列插入猪安全港位点，获得表达SEQ ID NO：14所示的PyMT的猪细胞，所述的猪安全港位点选自猪ROSA26、AAVS1、H11或COL1A1安全港位点。

2.根据权利要求1所述的猪细胞，其特征在于，所述的插入的编码PyMT的核苷酸序列如SEQ ID NO：39所示。

3.根据权利要求1或2所述的猪细胞，其特征在于，ROSA26安全港位点区域及其上下游各500bp的核苷酸序列如SEQ ID NO：40所示，AAVS1安全港位点区域及其上下游各500bp的核苷酸序列如SEQ ID NO：41所示，H11安全港位点区域及其上下游各500bp的核苷酸序列如SEQ ID NO：42所示，COL1A1安全港位点区域及其上下游各500bp的核苷酸序列如SEQ IDNO：43所示。

4.根据权利要求1-3任一所述的猪细胞，其特征在于，所述的编码PyMT的核苷酸序列在猪细胞中通过外源启动子调控，所述的外源启动子为MMTV-LTR，优选的，所述的MMTV-LTR的核苷酸序列如SEQ ID NO：15所示。

5.根据权利要求1-4任一所述的猪细胞，其特征在于，所述的猪细胞为猪成纤维细胞或乳腺细胞。

6.一种权利要求1-5任一所述的猪细胞的构建方法，其特征在于，使用安全港位点载体将编码PyMT的核苷酸序列插入猪安全港位点，所述的安全港位点载体包含编码PyMT的核苷酸序列和安全港位点载体骨架，所述的安全港位点载体骨架包含安全港插入位点的5’同源臂和3’同源臂，所述的编码PyMT的核苷酸序列位于5’同源臂与3’同源臂之间，所述的安全港位点载体骨架选自下列任一项所示：

A)ROSA26安全港位点载体骨架，其5’同源臂如SEQ ID NO：5所示，3’同源臂如SEQ IDNO：6所示；

B)AAVS1安全港位点载体骨架，其5’同源臂如SEQ ID NO：7所示，3’同源臂如SEQ IDNO：8所示；

C)H11安全港位点载体骨架，其5’同源臂如SEQ ID NO：9所示，3’同源臂如SEQ ID NO：10所示；

或D)COL1A1安全港位点载体骨架，其5’同源臂如SEQ ID NO：11所示，3’同源臂如SEQID NO：12所示。

7.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，使用sgRNA载体进行猪细胞的构建，所述的sgRNA载体包含靶向ROSA26、AAVS1、H11或COL1A1安全港位点的sgRNA，其中：

靶向ROSA26的sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：21所示，靶向AAVS1的sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：22所示，靶向H11的sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：23所示，靶向COL1A1的sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：24所示。