[发明专利]一种羧酯酶及其在动力学拆分环己烯甲酸酯生产环己烯甲酸中的应用

说明书

本发明公开了一种羧酯酶及其在动力学拆分环己烯甲酸酯生产环己烯甲酸中的应用，本发明提供的羧酯酶作为催化剂在不对称拆分手性环己烯甲酸酯制备手性环己烯甲酸的应用中，底物耐受性好，光学纯度高(ee_s值达99％以上)，反应条件温和，对环境友好，操作简便，易于工业放大。因此，本发明的羧酯酶及其基因具有很好的工业应用开发前景。

技术领域

本发明属于酶工程技术领域，尤其涉及一种羧酯酶及其在动力学拆分环己烯甲酸酯生产环己烯甲酸中的应用。

背景技术

(S)-3-环己烯-1-甲酸(分子式：C₇H₁₀O₂，分子量：126.15，沸点：118℃/6mmHg，CAS号为5708-19-0，是新型口服抗凝药依度沙班的关键手性中间体。

手性环己烯甲酸分子结构具有高度对称性，是合成医药、农药及其它精细化学品的重要手性砌块。研究人员已开发出多种光学活性手性酸合成的方法，包括动力学拆分和不对称合成。其中，利用酶法动力学拆分手性酯合成光学活性手性酸的途径，是生产光学纯环己烯甲酸的重要方法。另外，利用化学法合成手性环己烯甲酸的方法包括狄尔斯-阿尔德(Diels-Alder)反应和外消旋酸拆分法，其中Diels-Alder反应是目前合成手性3-环己烯-1-甲酸的主要方法，然而该方法操作难度大，反应条件苛刻，反应步骤繁琐，收率较低，因此其应用受到限制。另一化学拆分法需要在丙酮中进行至少六次重结晶才可分离出光学纯的对映异构体，导致丙酮的大量使用，拆分收率仅20～30％，原子经济性低。生物催化方法不仅反应条件温和、对环境友好，具有高度的区域选择性和立体选择性，而且避免了生产中有机试剂的大量使用，恰好弥补了化学方法的不足之处，因此近几年来生物催化的动力学拆分反应在手性酸合成中的应用越来越受到重视。

生物催化法立体选择性合成环己烯甲酸主要采用商品酶、野生菌或重组工程菌的细胞或游离酶进行催化。在前期的报道中，本实验室从自然界筛选到了可水解外消旋3-环己烯-1-甲酸甲酯的野生菌，现保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心，编号为CGMCCNo.17220。经过条件优化，菌株JNU9335可以产生233U·L^-1水解酶，在水/异辛烷两系统中可耐受高达1.0M底物。通过精确控制反应时间实现了(R)-3-环己烯-1-甲酸甲酯的完全水解，最终可获得(S)-3-环己烯-1-甲酸甲酯，ee_s值为99.6％，分离得率为34.7％(Enzyme.Microb.Tech.,2020,139,109580)。后期构建了JNU9335的鸟枪法基因文库，通过高通量筛选成功鉴定了目标酯酶AcEst1，可反应底物浓度是2.0M(280g/L)，是目前报道的最高水平，所用催化剂为本实验室筛选的重组表达的AcEst1(来源于Acinetobactersp.JNU9335，CGMCC No.17220)，反应20h后ee_s99％，分离得到715mM(S)-3-环己烯-1-甲酸甲酯(Bioresource Technol.,2020,317,123984)；虽然也有很多其它报道可以催化环己烯甲酸甲酯的不对称拆分，但都普遍存在光学活性偏低或底物上载量较低等问题,不具备规模化应用的可行性。2004年，Cihangir T等考察了一批商品酶包括猪肝酯酶PLE、马肝酯酶HLE和猪胰脂肪酶PPL在20℃条件下水解70mM外消旋3-环己烯-1-羧酸甲酯的效果。其中，PLE反应4h后，产物为(S)-3-环己烯-1-甲酸，光学纯度99％，产率为43％；HLE催化产物也为(S)-3-环己烯-1-甲酸，ee值为97％，产率有41％；PPL和前两者相反，水解产物为(R)-3-环己烯-1-甲酸，ee值为91％，产率为43％(Tetrahedron Asymmetry,2004,15,2057–2060)。然而，上述酶为动物来源的商品酶，其实际应用的过程中存在：价格昂贵、同工酶干扰、批次间差异较大和引入病毒的风险等。2016年，汪钊等人公开了一种商品蛋白酶拆分制备手性3-环己烯-1-甲酸的方法，以外消旋3-环己烯-1-甲酸甲酯为底物，在pH 7.5的磷酸盐缓冲液中反应，可获得(S)-3-环己烯-1-甲酸的ee值为99.5％，产率为32.8％(中国专利CN106119303B)。2019年，Xiafen Wu等设计了大肠杆菌酯酶BioH，通过合理的设计提高了其对(S)-3-环己烯-1-甲酸甲酯的对映选择性。通过空间和芳香相互作用的组合，阳性突变体Mu3(L24A/W81A/L209A)在水解外消旋3-环己烯-1-羧酸甲酯方面具有较高的(S)-选择性，ee值从32.3％(野生型)提高到70.9％。此外，优化了Mu3在3-环己烯-1-羧酸甲酯水解中的反应条件，在30℃和含有2.5％吐温80的磷酸盐缓冲液(pH8.0)中，Mu3可水解40mM底物，转化率提高了2倍(Biosci.Biotechnol.Biochem.,2019,83,1263–1269)。重组酶BioH虽然具有水解3-环己烯-1-甲酸甲酯的活性，但对映选择性较低。