[发明专利]一种基于ELP-Intein和ccdB的高效质粒载体及其使用方法

说明书

本发明涉及基因工程领域，具体的说是一种基于ELP‑Intein和ccdB的高效质粒载体及其使用方法。质粒载体为闭合环状的双链DNA，含有ccdB基因做作为负筛选标记，因此该载体能够灵活地进行无背景克隆。同时，该质粒载体含有T7启动子和终止子，并具有ELP‑Intein表达盒，可以高效地表达外源蛋白，还可用基于Intein自我切割的ELP标签和His‑tag标签双纯化法进行蛋白纯化。同时，将基于尿素的变性‑复性循环与基于ELP标签的纯化步骤相结合，可以有效的实现不溶性蛋白的纯化。本质粒载体的灵活克隆功能、高效表达功能、双纯化功能，特别是对于不溶性蛋白包涵体的纯化功能，将使得该载体及相应使用方法在基因工程领域具有广泛的应用前景。

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体的说是一种基于ELP-Intein和ccdB的高效质粒载体及其使用方法。该载体含有ccdB编码蛋白和多样化设计的多克隆位点，能够实现无背景粘性末端克隆、平末端克隆，并可以通过酶切方法自制T载体实现TA克隆；含有基于内含肽Intein自我切割的ELP蛋白和His-tag标签，通过可逆循环相变(ITC)及镍离子亲和层析实现便捷高效的蛋白纯化。这一纯化策略无需要使用咪唑，避免了咪唑对某些蛋白的抑制作用；同时也克服了经典ELP纯化步骤中需要透析除盐的步骤；同时，在细胞裂解液中加入高浓度尿素，从而将后续的基于ELP标签的纯化步骤与尿素的变性-复性循环有机地结合，从而有效的实现不溶性蛋白包涵体的复性和纯化。

背景技术

质粒可以被用于目的基因的分子克隆，也能够介导目的基因的蛋白表达和纯化。蛋白质分子分离纯化是生物工程中的关键技术问题之一，纯化过程所需成本高一直是亟待解决的问题。色谱分离法为目前纯化蛋白较成熟的方法。融合标签技术能够极大地简化重组蛋白质的纯化过程。这一技术主要是通过融合一段特定的标签多肽，比如His-tag，进行蛋白的融合表达。融合蛋白可以与固相基质上的特异配基(如Ni-NTA)结合，从而获得纯化的重组蛋白质(Li YJ,Chen YY,Bi LJ.Fusion tags technology and theirapplications.Chin J Biotech,2006,22(4):523-527.)。但是在采用Ni-NTA进行蛋白纯化时，在蛋白洗脱的步骤需要加入咪唑。而咪唑对于有些蛋白的活性有一定的影响。另外，很多蛋白在大肠杆菌中以包涵体的形式存在，所以在纯化蛋白之前必须要进行蛋白的变性和复性，使得纯化的步骤更复杂，也更耗时(Wingfield PT,Palmer I,Liang SM.Folding andPurification of Insoluble(Inclusion Body)Proteins from Escherichia coli.CurrProtoc Protein Sci.2014Nov 3；78:6.5.1-6.5.30.doi:10.1002/0471140864.ps0605s78.PMID:25367010；Seras-Franzoso J,Peternel S,Cano-GarridoO,Villaverde A,García-Fruitós E.Bacterial inclusion body purification.MethodsMol Biol.2015；1258:293-305.doi:10.1007/978-1-4939-2205-5_16.PMID:25447871.)。另外，有些时候His-tag等标签对蛋白的结构和性质会有一些影响，因此在纯化蛋白的过程中，往往需要通过蛋白酶酶切的方式去除标签，而这也增加了额外的工作量和成本。因此，设计能够克服上述缺点的质粒载体及其相应的蛋白纯化方式，将具有重要意义。