[发明专利]一种蛋白酶/聚丙烯酰胺水凝胶微球催化材料的制备方法和应用

说明书

本发明涉及一种蛋白酶/聚丙烯酰胺水凝胶微球催化材料的制备方法和应用，属于酶的固定化领域。该方法包括将含有丙烯酰胺单体和N,N‑亚甲基双丙烯酰胺的水相和含有乳化剂的有机相混合后，进行反相乳液聚合反应而得到聚丙烯酰胺水凝胶微球的步骤以及将蛋白酶物理吸附到所述聚丙烯酰胺水凝胶微球而得到蛋白酶/聚丙烯酰胺水凝胶微球催化材料的步骤。本发明所制备的凝胶微球催化材料安全无毒、易于从反应体系中分离、可循环利用，从而在生物催化、食品工业等各个领域都将有广泛的应用价值。

技术领域

本发明涉及一种蛋白酶-聚丙烯酰胺水凝胶微球催化材料的制备方法与应用，属于酶固定化领域。

背景技术

木瓜蛋白酶又称木瓜酶，是来源于番木瓜根、茎、叶和果实内的一种巯基蛋白酶，在未成熟的乳汁中含量最丰富。它是一种天然的植物蛋白酶，活性中心位点包含25位的半胱氨酸、159位的组氨酸和158位的天冬氨酸，这使得它具有蛋白酶和酯酶两种酶的活性，而且木瓜蛋白酶具有较宽的底物特异性，在酸性、中性、碱性环境下均表现出良好的分解蛋白质能力。此外，木瓜蛋白酶对温度的敏感度也并不是很强烈，在10-85℃这个范围内均有催化活性，但最适温度保持在55-65℃之间。这些性质使得木瓜蛋白酶在许多领域均有广泛应用。在食品领域中，木瓜蛋白酶主要应用于肉类嫩化、和酿酒产业中，还可以用来改性豆类制品，而在轻纺工业、化工及日用品中，木瓜蛋白酶被用来处理羊毛、制造牙膏和护肤化妆品等。在医药方面，木瓜蛋白酶还会被用于治疗皮肤溃疡、清理创口等。然而，实际生产中苛刻的环境条件会使木瓜蛋白酶的活力受到极大的影响，这也会导致酶的催化活性降低。因此，为了提高木瓜蛋白酶的使用效率，降低生产成本，多年来对其的固定化研究较多，已有不少研究者利用不同的固定化方法对其进行固定，而且发现一种固定过程无毒，能快速与反应液分离，并且具有较高酶活的固定化方法是非常必要的。

传统的酶固定方法分为四大类，物理吸附法、包埋法、共价结合法、交联法。物理吸附法是最早的固定化方法，分为表面吸附和孔道吸附。这种方法固定的酶，酶的构象变化小或基本不变，简单易操作，载体种类选择广泛，但缺点是酶与载体之间的结合力弱，酶易泄漏，而且载体对酶的尺寸大小要求较高。利用共价结合法与交联法固定的酶虽然载体与酶结合牢固，但这两种方法均操作复杂，且会引起构象的变化是的酶的性能发生改变。包埋法是较为普遍的固定化方法，这种方法虽然操作简单，但存在扩散限制、传质受阻等问题，不适合催化大分子底物。总而言之，酶的固定化最终目的就是使酶以最大活性的方式在固定化过程中保留下来。

众多的研究表明，在这些材料当中，相对较软、生物相容性较好，具有交联网络结构的水凝胶是一类理想的固定化酶基材。用这种基材固定酶易于分离，不仅可以保留酶的最大活性，其具有的机械性能还可以有效增强酶的稳定性。水凝胶也会为酶提供一种半湿润的环境，这种环境对维持酶的活性非常重要。但传统的水凝胶通常以形成对酶的包封来达到固定化效果，这样就极大的增加了酶与底物的传质阻力。本发明制备出一种聚丙烯酰胺水凝胶微球，这种微球载体表面积大，酶的负载能力强，且具有水凝胶一切的生物性能，能够最大程度的保持酶的活力。而且这种微球表面富含酰胺键，可以通过物理吸附与木瓜蛋白酶固定化，使酶的天然构象得以完全保留。

发明内容

鉴于上述现有技术中存在的问题，本发明提供一种蛋白酶/聚丙烯酰胺水凝胶微球催化材料及其的制备方法以及其的应用，将丙烯酰胺、N,N-亚甲基双丙烯酰胺溶于水相后与含有乳化剂的有机相混合，形成反相乳液，加入引发剂后进行聚合反应生成聚丙烯酰胺水凝胶微球，再将蛋白酶物理吸附到微球上，得到蛋白酶/聚丙烯酰胺水凝胶微球催化材料。本发明利用聚丙烯酰胺凝胶微球表面丰富的酰胺键与酶分子发生物理作用，达到固定的效果。并且凝胶微球易于从反应体系中分离，其网状结构使载体的酶负载量大大提高，本身具有的机械性能也极大提高了酶的稳定性。

本发明的技术方案如下：