[发明专利]用于制备凝血酶的方法

说明书

本发明涉及使用给定BaSO₄试剂作为凝血酶原的吸附剂，由凝血酶原来源生产凝血酶的方法，以及评估给定BaSO₄试剂用于制备凝血酶的适合性的方法。在至少一个实施例中，该方法包括使给定BaSO₄试剂的样品与凝血酶原来源接触，以获得BaSO₄吸附的凝血酶原，并且随后评估BaSO₄吸附的凝血酶原的促凝活性。在另一个实施例中，该方法包括相对于正常哺乳动物血浆的促凝活性评估的步骤。

本申请是申请日为2015年02月06日、申请号为201510064089.2、名称为“用于制备凝血酶的方法”的专利申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及凝血酶生产领域，并且更具体而言，涉及评估给定BaSO₄试剂用作凝血酶制备中的凝血酶原吸附剂的适合性的方法。

背景技术

凝血酶是通过催化纤维蛋白原转化为纤维蛋白而促进血液凝固的丝氨酸蛋白酶。凝血酶还负责活化血小板并且通过多重蛋白酶解反馈机制间接负责其自身生产和抑制的调节。凝血酶还涉及因子VIII、因子V、因子XI、因子XIII和蛋白质C的活化。凝血酶作为凝血因子而广泛用于临床应用中，通过将纤维蛋白原转化为纤维蛋白来止住伤口的出血。凝血酶是外科敷料的常见组分，并且已与纤维蛋白原及其他凝血蛋白质组合用于二组分止血系统诸如纤维蛋白胶、粘合剂和密封剂中。

凝血酶通过前体(酶原)凝血酶原的蛋白酶解活化而产生。为了产生凝血酶，凝血酶原必须在两个位点处被切割，生成中间产物。凝血酶原在体内转化为凝血酶通过凝血酶原酶复合物催化，所述凝血酶原酶复合物包括活化的因子X和因子V，并且在钙离子的存在下在带负电的磷脂膜上装配。

凝血酶可通过使凝血酶原来源(诸如血浆或血液级分)与固体吸附剂接触由凝血酶原进行制造，所述固体吸附剂能够吸附来自凝血酶原来源的凝血酶原，例如硫酸钡(BaSO₄)。固体吸附剂通常使用洗涤溶液进行洗涤，以去除污染物诸如未结合的蛋白质，并且随后使用洗脱溶液由其洗脱凝血酶原。在另外的任选纯化和加工步骤后，洗脱的凝血酶原可通过使用活化剂例如钙离子活化而转化为凝血酶。

据报道当使用不同BaSO₄试剂，诸如得自不同制造商的BaSO₄试剂，或甚至由特定制造商生产的不同试剂批次时，在来自给定体积的凝血酶原来源的凝血酶得率中存在显著差异。

在报道中已提出凝血酶得率中的差异至少部分可归于通过不同BaSO₄试剂的凝血酶原吸附中的变化，并且吸附能力是选择BaSO₄试剂用于凝血酶原吸附的关键因素。Surgenor和Neortker(1952)陈述某些BaSO₄试剂在吸附来自血浆的凝血酶原方面比其他试剂更有效，而Voss D.(1965)注意到当使用不同BaSO₄试剂用于吸附凝血酶原复合物时，在吸附相同量的凝血酶原复合物所需的BaSO₄量中发现显著差异，并且推测这是由于其晶体结构中的差异。然而，在本申请人的情况下，已测试了不同BaSO₄批次的形态，并且未测定到显著差异。另外，一些离子例如Ca²⁺据报道促成对于不同BaSO₄批次的不同吸附率，并且在本文情况下，在不同BaSO₄批次中Ca²⁺的存在也没有显著不同。

凝血酶制造商尝试通过借助于试误法从多重不同BaSO₄试剂中选择合适的BaSO₄试剂来增加凝血酶得率。

发明内容