[发明专利]特异性识别FPV的核酸适配体

说明书

特异性识别FPV的核酸适配体，它涉及一种核酸适配体。本发明的目的是提供一种特异性识别FPV的核酸适配体。本发明特异性识别FPV的核酸适配体的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。本发明特异性识别FPV的核酸适配体80个核苷酸组成，预测其二级结构具有茎环结构。本发明公开了一种特异性识别FPV的核酸适配体，该核酸适配体具有良好的亲和力和特异性，可人工合成，因而成本低、生产周期短、不同批次间的重复性较好，其稳定性也较高，可长期保存，也便于化学修饰。

技术领域

本发明涉及一种核酸适配体。

背景技术

猫细小病毒(feline parvovirus，FPV)属于细小病毒科(Parvoviridae)细小病毒属(Parvovirus)，单股无囊膜线状DNA病毒，主要感染家猫与其他猫科动物，也感染鼬科和烷熊科(包括烷熊、狐狸和水貂)等多种动物。能引起高热，呕吐，肠炎，白细胞减少等典型的急性，高度接触性疾病，死亡率60％～70％。易感动物一旦发病，便会立即在周围环境中广泛的流行，呈急性经过或地方性流行，造成非常高的死亡率。

核酸适体是指利用SELEX技术从人工合成的随机寡核苷酸文库中筛选出的对靶标具有特异性相互作用的单链DNA或RNA。核酸适配体的某些性质与抗体很类似，几乎可以应用于抗体所涉及的一切领域，然而与抗体相比，它又具有自己独特的优点：其具有靶分子范围广、分子质量小、免疫原性低、易于化学合成、改造和标记等优点。

发明内容

本发明的目的是提供一种特异性识别FPV的核酸适配体。

本发明特异性识别FPV的核酸适配体的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明特异性识别FPV的核酸适配体80个核苷酸组成，预测其二级结构具有茎环结构。

本发明建立的FPV核酸适配体筛选随机文库为AGCAGCACAGAGGTCAGATG-N(40)-CCTATGCGTGCTACCGTGAA。

本发明适配体的正向引物序列为5’-AGCAGCACAGAGGTCAGATG-3’；反向引物序列为5’-TTCACGGTAGCACGCATAGG-3’。

本发明特异性识别FPV的核酸适配体的筛选方法：

一、初始FPV核酸适配体筛选随机文库的构建：随机文库为含有80个碱基的单链DNA(ssDNA)文库，中间40个为随机序列，两边为固定序列；随机文库为5’-AGCAGCACAGAGGTCAGATG-N(40)-CCTATGCGTGCTACCGTGAA-3’(80nt)；适配体上下游引物分别为5’-AGCAGCACAGAGGTCAGATG-3’和5’-TTCACGGTAGCACGCATAGG-3’；

二、核酸适配体的筛选：

2.1、FPV与NHS琼脂糖磁珠偶联制备FPV-磁珠混合物；

2.2、将随机文库与FPV-磁珠混合物孵育，之后用PBS洗脱未结合在FPV-磁珠上的ssDNA；

2.3、洗脱结合在FPV-磁珠上的ssDNA，将收集到的ssDNA乙醇沉淀，并重新重悬于超纯水中，作为PCR反应的模板；

2.4、进行PCR反应条件的优化，在最优的PCR条件下，用Biotion标记的上游引物进行PCR扩增；

其中用链霉亲和素磁珠将Biotion标记的扩增产物拆分成ssDNA，作为下一轮筛选的文库；

三、克隆测序：

经过N轮筛选，得到了一组高亲和力核酸适配体；利用无修饰适配体上下游引物进行PCR扩增后，切胶纯化回收，进行克隆测序；

四、候选适配体的筛选：采用Dot-blot方法筛选候选适配体；