[发明专利]酿酒酵母单一含硒蛋白的制备方法

说明书

本发明公开了一种酿酒酵母单一含硒蛋白的制备方法。步骤如下：克隆酿酒酵母中含有半胱氨酸的蛋白相对应的基因，连接到原核表达载体上，转入原核表达宿主；构建好的菌株活化后转接到新鲜的LB培养基中培养，冰上冷却，然后加入终浓度为0.1‑0.5mM的IPTG，培养10h，加入终浓度为0.5‑2.5mM的硒源培养0.5‑1h；收集菌体，去除上清，然后用BindingBuffer重悬细胞，超声破碎，4℃，6500‑8500G离心20‑40min，取上清，用镍柱纯化目的蛋白，洗脱液为Elution Buffer。本发明获得了酿酒酵母单一含硒蛋白，纯化后的蛋白纯度高，成本廉价，操作简单。

技术领域

本发明属于微生物学和发酵工程领域，具体涉及一种酿酒酵母单一含硒蛋白的制备方法。

背景技术

硒是人体不可或缺的微量元素，缺硒会表现为脱发、脱甲等症状。随着科学技术的发展， 硒的生物学功能逐渐被发现，目前，已知的硒的生物学功能包括：抗氧化，抗衰老，保护和 修复细胞，提高人体免疫力，预防癌变等等。硒的这些生物学功能主要以硒蛋白来实现。硒 的存在形式可分为有机硒和无机硒，常见的无机硒包括硒酸盐，亚硒酸盐和硒化物等，常见 的有机硒包括硒代甲硫氨酸，硒代半胱氨酸和硒代胱氨酸等。无机硒很难被人体直接吸收发 挥微量元素硒的生物学功能，而有机硒可以。此外，无机硒毒性较大，不适合用于动物和人 食用。传统的获得酿酒酵母含硒蛋白的方法是通过对富硒酵母破壁，纯化后获得含硒蛋白， 但是由于酿酒酵母壁厚，采用破壁和化学提纯获得含硒蛋白的效率不高，而且蛋白容易失活， 极大的限制了硒蛋白的应用。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种酿酒酵母单一含硒蛋白的制备方法。

为实现上述目的，本发明提供一种酿酒酵母单一含硒蛋白的制备方法，其特征在于：采 用原核表达系统异源表达酿酒酵母中一个含有半胱氨酸的蛋白，添加硒源，收集样品纯化分 离获得酿酒酵母单一含硒蛋白，步骤如下：

(1)克隆酿酒酵母中含有半胱氨酸的蛋白相对应的基因，连接到原核表达载体上，转入 原核表达宿主；

(2)诱导表达蛋白后，添加硒源：

将构建好的菌株活化后转接到新鲜的LB培养基中，然后加入IPTG，再加入硒源培养；

(3)收集菌体，去除上清，然后用Binding Buffer重悬细胞，超声破碎，取上清，用镍 柱纯化目的蛋白，洗脱液为ElutionBuffer。

作为优选方案，采用的表达系统为原核表达系统。

进一步地，采用的原核表达菌株为大肠杆菌BL21(DE3)，表达载体为pET26b。

更进一步地，所述步骤(2)中诱导表达条件为37℃，200rpm培养1.5h，冰上冷却5-10 min，然后添加终浓度为0.1-0.5mM IPTG，16-22℃，120-150rpm培养10h；添加硒源后共孵育时间为0.5-1h，共孵育条件为37℃，200rpm。

更进一步地，所述步骤(2)中添加的IPTG终浓度为0.1-0.5mM；添加的硒源终浓度为 0.5-2.5mM；所述添加的硒源为亚硒酸钠或亚硒酸钾。

更进一步地，所述步骤(3)中采用细胞破碎方法为超声破碎，收集破碎后上清所用的离 心参数为4℃，6500-8500G，20-40min。

更进一步地，所述步骤(3)中采用纯化蛋白方法为镍柱纯化，洗脱液为ElutionBuffer： 300-500mM咪唑，20mM Tris-HCl，0.5M NaCl，pH 7.9。

更进一步地，所述步骤(1)中从酿酒酵母中选取含有半胱氨酸的蛋白RPL14B，依据酿 酒酵母rpl14b基因序列设计引物如下：

pET26b-RPL14B-NdeI-pf：其序列如SEQ 1所示；