[发明专利]冷冻保存有蹄类动物胚胎

权利要求书

1.一种制备体外生产的有蹄类动物胚胎的方法，所述方法包括步骤：

在第一孵育条件下体外孵育未成熟的卵母细胞以获得成熟的卵母细胞；

使所述成熟的卵母细胞受精从而产生受精卵；

剥露所述受精卵；

在第二孵育条件下孵育所述受精卵以制备所述体外生产的有蹄类动物胚胎，所述第二孵育条件包括含5％氧(O₂)和5％二氧化碳(CO₂)的环境；

冷冻所述体外生产的有蹄类动物胚胎，其中所述冷冻包括以下步骤：

(1)在10℃和38℃之间的第一温度下，在包含1.0-4M乙二醇的冷冻溶液中孵育所述胚胎5-30分钟；

(2)将所述胚胎装载到容器中，其包括添加：

i)第一解冻溶液至所述容器；

ii)第一气泡和第二解冻溶液，其中所述第一气泡分隔所述第一和第二解冻溶液；

iii)第二气泡和冷冻溶液中的所述体外生产的有蹄类动物胚胎，其中所述第二气泡分隔所述第二解冻溶液和冷冻溶液中的所述体外生产的有蹄类动物胚胎；

iv)第三气泡；

v)第三解冻溶液，其中所述第三气泡分隔冷冻溶液中的所述体外生产的有蹄类动物胚胎和所述第三解冻溶液；

vi)第四气泡；和

vii)第四解冻溶液，其中所述第四气泡分隔所述第三和第四解冻溶液，并且，所述第一、第二、第三和第四解冻溶液包含在等渗稀释溶液中的乙二醇；

(3)将所述胚胎暴露于-2至-10℃的温度，持续1分钟至60分钟的时间段；

(4)以每分钟-0.2至-0.8℃的速度降低所述温度，直到达到-30至-36℃的第二温度；和

(5)将所述胚胎浸入液氮中储存。

2.如权利要求1所述的方法，还包括在雌性中诱导排卵和从所述雌性的生殖系统抽吸所述未成熟的卵母细胞的步骤。

3.如权利要求1所述的方法，其中在所述第一孵育条件下体外孵育所述未成熟的卵母细胞包括：

在35-40℃下在存在3-9％CO₂和饱和湿度的条件下孵育所述未成熟的卵母细胞。

4.如权利要求1所述的方法，其中使所述成熟的卵母细胞受精的步骤持续20-24小时。

5.如权利要求4所述的方法，其中使所述成熟的卵母细胞受精的步骤是在存在5％O₂的条件下进行的。

6.如权利要求1所述的方法，其中所述的对受精卵的孵育持续5至9天，并且所述第二孵育条件包括在矿物油作用下，补充有牛血清白蛋白(BSA)的培养基。

7.如权利要求1所述的方法，其中所述乙二醇以约0.2至和约1.3摩尔之间的范围内的最终浓度存在于冷冻溶液中。

8.如权利要求6所述的方法，其中所述培养基选自下组：C4培养基、SOF培养基、SOFaa培养基及其组合。

9.如权利要求1所述的方法，其中所述体外生产的有蹄类动物胚胎处于选自下组的发育阶段：桑葚胚、早期胚泡、胚泡和扩张囊胚。

10.如权利要求1所述的方法，其中所述体外生产的有蹄类动物胚胎或未成熟的卵母细胞是选自下组的有蹄类动物的胚胎或卵母细胞：普通牛、瘤牛和瘤牛-普通牛的杂交品种。

11.如权利要求1所述的方法，还包括解冻所述冷冻的体外生产的有蹄类动物胚胎，所述方法包括：

将含有在冷冻溶液中的冷冻胚胎的容器暴露于第一解冻环境持续足以解冻所述解冻溶液的第一时间段；

将所述容器暴露于10℃和38℃之间的解冻温度的第二解冻环境持续足以解冻所述冷冻溶液的第二时间段；和

在所述容器内混合所述解冻溶液、所述冷冻溶液和所述胚胎。