[发明专利]一种氘代犬尿氨酸及其在多肽中氨基酸构型分析中的应用

说明书

本发明提供了一种氘代犬尿氨酸及其在多肽中氨基酸构型分析中的应用，包括氘代犬尿氨酸的合成过程、基于高分辨质谱和核磁技术的对氘代犬尿氨酸的结构确证、将其作为对照品通过液相色谱‑高分辨质谱确定达托霉素中犬尿氨酸的构型。本发明首次确定出氘代犬尿氨酸的氘代位点及氘代个数，同时可判断多肽中犬尿氨酸的构型，适用于多肽类药物的质量控制。

技术领域

本发明涉及药物化学和药物分析化学领域，尤其涉及一种氘代犬尿氨酸及其在多肽中氨基酸构型分析中的应用。

背景技术

达托霉素为环脂肽类抗生素，在体内外对耐药革兰氏阳性菌具有强力杀菌作用。达托霉素由10个氨基酸残基组成环肽部分、3个氨基酸组成线性肽部分、末端氨基酸连接癸酰基脂肪链，结构式I如下：

氨基酸构型的变化对达托霉素的抗菌活性影响很大(彭希希,王赛赛,付琛,胡昌华,廖国建.药学学报,2018,53(6):839-844)，必须建立合理的方法对达托霉素中的氨基酸及其构型进行监控以保证药品安全。

目前，对氨基酸构型的分析为多肽在盐酸中加热水解、再采用手性衍生法经液相色谱或液相色谱质谱法进行分析，但这种方法不能排除加热过程是否存在α-碳构型转化。选择氘代盐酸重水溶液作为水解试剂，如果α-碳发生构型转化，则α-碳上的氢可以转化为氘，并且洗脱时间发生变化，以此可以区分是否是加热过程发生了构型转化。

达托霉素中犬尿氨酸(Kynurenine，Kyn)为非蛋白质氨基酸，结构式II如下。目前尚无报道氘代犬尿氨酸制备方法、氘代位点及应用的文献(张佳宇,苑振宽,张宇,韩维娜.哈尔滨医科大学学报,2014,48(3):255-259；Murai Y,Wang L,Masuda K,Sakihama Y,Hashidoko Y,Hatanaka Y,Hashimoto M.2013,2013(23),5111-5116)。

在此基础上，对氘代犬尿氨酸的结构进行研究，并将氘代犬尿氨酸应用至达托霉素中的氨基酸构型分析中，是一个重要的研究方向。

发明内容

为实现上述技术目的，本发明提供了一种氘代犬尿氨酸及其在多肽中氨基酸构型分析中的应用，包括氘代犬尿氨酸的合成过程、基于高分辨质谱和核磁技术的对氘代犬尿氨酸的结构确证、将其作为对照品通过液相色谱-高分辨质谱确定达托霉素中犬尿氨酸的构型。

第一方面，本发明提供了一种氘代犬尿氨酸，其结构式(1)、(2)为

第二方面，本发明提供了一种上述氘代犬尿氨酸的制备方法，具体包括以下步骤：

步骤S1、加热水解：将L-犬尿氨酸(3)溶解于氘代盐酸重水溶液中，浓度为0.5mg/mL-20mg/mL，充氮密封，加热后得到第一混合溶液；

步骤S2、所述第一混合溶液经液相色谱进行纯化，收集氘代犬尿氨酸馏分，冻干，得微黄色粉末状氘代犬尿氨酸；

所述液相色谱的具体操作条件为：采用十八烷基键合硅胶反相色谱柱，流动相A为0.01-1％甲酸水溶液，流动相B为乙腈或甲醇，流动相A：流动相B＝40:60-10:90(v/v)，流速设定为0.5-2mL/min，柱温为25-40℃，进样量为10-100μL，吸收波长为190-280nm。

优选地，所述氘代盐酸重水溶液的摩尔浓度为4-10mol/L。

优选地，所述加热的温度为85℃-130℃，所述加热的时间为5h-24h。

第三方面，本发明提供一种达托霉素中犬尿氨酸构型的检测方法，具体包括以下步骤：

步骤A1、手性Marfey’s试剂衍生：