[发明专利]一种大肠癌标记物DCD的Q-PCR检测方法

说明书

本发明涉及体外检测技术领域，具体涉及一种大肠癌标记物DCD的Q‑PCR检测方法。该方法包括样品的RNA提取、逆转录和Q‑PCR扩增。本发明将DCD作为大肠癌候选的诊断指标及治疗标靶，先提取细胞或组织的RNA，设置内参引物和DCD基因引物分别对RNA进行逆转录，得到两组不同的扩增产物，再分别进行Q‑PCR反应，分别得到两组扩增产物的熔解曲线和扩增曲线，从而计算出DCD基因的表达水平；然后将其与正常组织或细胞中DCD的mRNA浓度对比，若受试组织或细胞中的DCD的mRNA浓度高于正常的1倍以上，则可认为该受试组织或细胞是的大肠癌组织或大肠癌细胞，有助于大肠癌的早期诊断。

技术领域

本发明涉及体外检测技术领域，具体涉及一种大肠癌标记物DCD的Q-PCR检测方法。

背景技术

DCD(Dermcidin)是2001年德国科学家Schittek等人从人体汗液中分离得到的一种天然活性肽，DCD最初被认为在汗腺中有着特异性表达，在汗腺中表达并分泌至汗液中，有一定的抗菌活性。后来的研究发现，DCD也在某些癌症中表达，包括黑色素瘤、皮肤肿瘤癌、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、肺癌和肝细胞癌。DCD很可能是一个潜在的致癌因素，能作为治疗这些癌症的候选治疗标靶。

通过实验研究证实，DCD在肿瘤发病率位居全球第3位的大肠癌中存在高表达，能成为大肠癌的诊断指标及治疗标靶。然而DCD在大肠癌细胞中的检测方法则尚未系统的建立。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种大肠癌标记物DCD的Q-PCR检测方法，采用Q-PCR技术通过检测细胞中DCD的mRNA序列，来判断是否患有大肠癌。

本发明的目的采用如下技术方案实现：

一种大肠癌标记物DCD的Q-PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)样品的RNA提取；

2)逆转录：将步骤1)提取的RNA配制第一链cDNA合成反应液，进行cDNA合成反应，得到cDNA；

3)Q-PCR扩增：以步骤2)中的cDNA为模板，用如SEQ ID NO.1所示的上游引物和和SEQ ID No.2所示的下游引物，进行PCR扩增，得到第一扩增产物；其中，第一扩增产物为对照组，即human-ACTB内参基因组；

以步骤2)中的cDNA为模板，用如SEQ ID NO.3所示的上游引物和和SEQ ID No.4所示的下游引物，进行PCR扩增，得到第二扩增产物；其中，第二扩增产物为实验组，即DCD基因组；

SEQ ID NO.1：CATGTACGTTGCTATCCAGGC；

SEQ ID NO.2：CTCCTTAATGTCACGCACGAT；

SEQ ID NO.3：AGCCAAGGAAGCAGAGATCC；

SEQ ID NO.4：CTTCGACTGCATCTTTTCCTAGT；

4)分析：分别得出第一扩增产物的扩增曲线和熔解曲线以及第二扩增产物的扩增曲线和熔解曲线，计算出DCD基因的相对表达量，再与正常大肠细胞或组织中DCD基因的相对表达量对比，判断该样品是否为大肠癌组织或大肠癌细胞。

根据2-△△Ct公式计算基因扩增：2-△△Ct表示的是实验组DCD基因的表达相对于对照组的变化倍数，使用这一方法可以直接得到DCD基因相对于内参基因的定量。ΔΔCt＝(CtDCD基因-Ct内参基因)实验组-(CtDCD基因-Ct内参基因)对照组，则实验组目标基因的表达水平为对照组的2-△△Ct倍。

计算出样品的DCD基因的相对表达量后，与正常大肠细胞或组织中DCD的mRND浓度进行对比，可得出该样品是否为肠癌细胞或组织，为临床提供新的诊断思路。