[发明专利]结核分枝杆菌利福平和异烟肼耐药突变检测试剂盒及方法

说明书

本发明提供了一种结核分枝杆菌利福平和异烟肼耐药突变检测试剂盒及方法，具体地，本发明公开了一种基于荧光PCR熔解曲线法检测结核分枝杆菌利福平和异烟肼耐药突变的方法及试剂盒，能够在体外快速定性检测结核病患者的结核分枝杆菌复合群阳性的痰液培养物样本中利福平耐药基因rpoB和异烟肼耐药基因katG、inhA、ahpC耐药决定区耐药突变。

技术领域

本发明属于生物技术和分子诊断领域，具体地说，本发明涉及一种结核分枝杆菌利福平和异烟肼耐药突变检测试剂盒及方法。

背景技术

结核病为结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)引起的慢性传染性疾病。利福平(rifampicin，RIF)是利福霉素的半合成衍生物，是目前最主要的一线抗MTB药物，该药物通过与细菌RNA聚合酶β亚基结合干扰并抑制细菌的转录过程，实现杀菌效果。研究表明，约有95％以上的利福平耐药性是由rpoB基因的81bp(编码密码子507-533位)的利福平耐药决定区(rifampicin resistance determing region,RRDR)的突变包括点突变或短的插入、缺失突变等引起，使DNA依赖性RNA聚合酶β亚单位酶活性改变，利福平不能与细菌RNA聚合酶β亚单位结合而表现为耐药。rpoB基因突变一般是单个碱基突变或数个碱基联合突变，约80％-86％的碱基突变发生在3个氨基酸位点上，分别为531位的丝氨酸转换为亮氨酸、526位的组氨酸转换为酪氨酸、516位的天冬氨酸转换为缬氨酸、酪氨酸、甘氨酸等。

异烟肼(isoniazid,INH)，是抗结核病的常用一线药物，在结核病的治疗中一直起着重要的作用。但大多数结核病患者如果长期用药易产生耐药性，这主要是由于长期使用INH可诱导细菌产生基因突变，从而使细菌对INH的耐药性增强。目前已发现数个涉及异烟肼体内代谢过程中活性中间体形成有关的基因，其中katG、ahpC和inhA基因发生突变的频度最高。异烟肼耐药基因katG基因的3个突变密码子309、315、316，inhA基因的2个突变密码子-8、-15，ahpC基因的12个突变碱基-46、-44、-40，-39、-34、-32、-30、-15、-12、-10、-9、-6和3个突变密码子2、3、5进行耐药筛选。

MTR-TB的早期诊断和治疗是目前结核病控制的热点和难点之一。目前已有的分子生物学检测方法有Xpert MTB/RIF系统用于结核病的快速诊断和利福平耐药性检测及PCR-单链构象多态性分析(PCR-SSCP)、限制性片段长度多态性分析(PCR-RFLP)以及基因测序(genetic sequencing)等检测MTB耐药基因，供临床选择应用。但这些方法PCR后处理操作步骤繁琐，对技术人员要求较高，且存在一定的交叉污染，不利于广泛推广。

(1)Xpert MTB/RIF快速检测利福平的耐药性：这是一种全新的快速诊断结核病和检测MTB耐药性的系统，该系统针对MTB的81bp利福平耐药核心区间设计引物、探针，并进行扩增检测，根据其是否发生基因突变来检测样本中是否含有MTB及其是否对利福平耐药，可以全自动地对样本进行核酸提取、纯化及浓缩，在2h内出结果。但是Gene-xpertMRT/RIF法出现假阴性的可能性较大，有可能导致患者被误诊为耐多药结核病而使疗程延长，不良反应增多，因此有其局限性，最终结果仍需结核菌药敏结果证实。

(2)聚合酶链反应-单链构象多态性分析(Polymerase Chain Reaction-SingleStrand Conformation Polymorphism,PCR-SSCP)：细菌的DNA基因片段在大多情况下，片段中单一碱基的置换即足以引起单链DNA空间构象的改变，这种改变又可导致该单链DNA电泳迁移率的相应变化，SSCP技术正是采用这一原理将含有突变的DNA片段与正常DNA片段通过电泳加以区分。不足之处主要是可能检出假阴性结果，对于未知基因变异的检测，假阴性结果就难以百分之百地消除。