[发明专利]一种构建瘦肉率高、生长快的优质猪核移植供体细胞的基因编辑系统及其应用

说明书

本发明公开了一种构建瘦肉率高、生长快的优质猪核移植供体细胞的基因编辑系统及其应用。一种用于猪SST‑MSTN基因编辑的CRISPR/Cas9系统，包含Cas9表达载体、针对猪MSTN基因的gRNA表达载体以及针对猪SST基因的gRNA表达载体。本发明分别针对MSTN基因和SST基因的不同靶点设计了相应的gRNA表达载体，通过筛选获得具有较高编辑效率的gRNA及其表达载体。配合本发明改造的Cas9高效表达载体进行基因编辑，编辑效率比原载体有了显著的提高。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及用于MSTN、SST双基因编辑的CRISPR/Cas9系统及其在构建瘦肉率高、生长快的优质猪核移植供体细胞中的应用。

背景技术

猪是我国最早驯化的家畜之一，其在历史的长河中一直是人类重要的肉料动物。中国人爱食猪肉，与千百年来的饮食文化有关。2000年以来，猪肉在我国的肉类消费占比中都超过70％，是我国最主要的消费肉类。目前我国城市瘦肉的价格已超过肥肉价格近1倍左右，具有60％以上瘦肉率的瘦肉型猪备受青睐，而瘦肉率性状尚有进一步提升的空间。另一方面，目前国内的育肥猪出栏体重为120kg左右，猪只从出生到出栏大约需要180天，如能加快猪只的生长速度就能够降低育肥猪的出栏时间。因此，培育瘦肉率更高、生长速度更快的猪品系将能够为养猪生产提供更多的经济效益。

肌抑素(Myostatin,MSTN)属TGF-β超家族,是骨骼肌生长的负调控因子,参与肌纤维增生和肥大的调控，其缺失或突变会导致双肌现象的产生。该基因的发现对于畜牧业和医学领域都有重大意义。生长抑素(Somatostatin,SST)是一种抑制垂体生长激素、促甲状腺激素、促肾上腺皮质激素等激素释放的蛋白，其能够通过抑制一系列与生长有关的激素从而抑制生长。已有研究表明，抑制MSTN的表达能够一定程度增加肌肉沉积，增加猪只的瘦肉率，而抑制SST的表达则能够一定程度加快猪只的生长速度、降低料肉比。

基因编辑是近年来不断取得重大发展的一种生物技术，其包括从基于同源重组的基因编辑到基于核酸酶的ZFN、TALEN、CRISPR/Cas9等编辑技术，其中CRISPR/Cas9技术是当前最先进的基因编辑技术。因此，本发明采用CRISPR/cas9技术进行了MSTN和SST双基因的突变，并获得了双基因联合敲除的单细胞克隆，为后期通过体细胞核移植动物克隆技术培育瘦肉率高、生长快的高生产性能优质猪种奠定了基础。MSTN和SST的功能丧失将能够有效提高猪的瘦肉率和生长速度，从而提高养猪业的经济效益。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种用于猪SST-MSTN基因编辑的CRISPR/Cas9系统。

本发明的另一目的是提供该CRISPR/Cas9系统的应用。

本发明的又一目的是提供一种重组细胞及其应用。

本发明的目的可通过以下技术方案实现：

一种用于猪SST-MSTN基因编辑的CRISPR/Cas9系统，包含Cas9表达载体、针对猪MSTN基因的gRNA表达载体以及针对猪SST基因的gRNA表达载体；所述的Cas9表达载体为质粒全序列如SEQ ID NO.2所示的pU6gRNA-eEF1a-mNLS-hSpCas9-EGFP-PURO载体。

作为本发明的一种优选，针对猪MSTN基因的gRNA表达载体和针对猪SST基因的gRNA表达载体的载体骨架均为pKG-U6gRNA，其质粒全序列如SEQ ID NO.3所示。

作为本发明的进一步优选，针对猪MSTN基因的gRNA表达载体表达SEQ ID NO.32所示的gRNA，其靶点如SEQ ID NO.20所示；针对猪SST基因的gRNA表达载体表达SEQ ID NO.51所示的gRNA，其靶点如SEQ ID NO.39所示。