[发明专利]一种芦笋U6基因启动子AspU6p3及其克隆与应用

说明书

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种芦笋RNA聚合酶III型启动子，更具体涉及一种芦笋U6基因启动子AspU6P3，并进一步公开其克隆方法与应用。本发明首次在“蔬菜之王”芦笋栽培种中克隆获得芦笋RNA聚合酶III型启动子‑‑芦笋内源U6启动子AspU6P3，该启动子为芦笋内源RNA聚合酶III型启动子，该启动子具有高效转录活性，可驱动下游sgRNA的表达，并通过芦笋稳定遗传转化体系验证了内源U6启动子AspU6P3的活性及其应用于芦笋CRISPR/Cas9基因编辑系统的可行性，并首次实现了CRISPR/Cas9介导的芦笋基因组靶向编辑。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种芦笋RNA聚合酶III型启动子，更具体涉及一种芦笋U6基因启动子AspU6P3，并进一步公开其克隆方法与应用。

背景技术

芦笋(Asparagus officinalis L.)，又名石刁柏，属天门冬科天门冬属多年生宿根性单子叶草本植物。其鲜笋质嫩味美，营养丰富，风味独特，是一种深受消费者喜爱的营养保健型高档蔬菜，全球贸易，经济价值高，被誉为“蔬菜之王”。目前我国芦笋种质创制与新品种选育仍然是以传统的杂交育种为主。由于芦笋雌雄异株，基因型高度杂合，基因组较大，多年生，且以动态的嫩茎为主要收获对象，导致了常规育种存在效率低、周期长的问题，这严重地阻碍了芦笋育种的进程。为此，2017年江西省农业科学院联合国内外多家研究机构共同完成了世界上首个芦笋全基因组序列图谱绘制，拉开了芦笋分子育种的序幕；预测共有27656个编码基因，然而绝大多数基因的功能并不清楚。

CRISPR/Cas(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/associated protein，成簇的、规律间隔的短回文重复序列及相关蛋白)系统是近年发展起来的、由导向RNA介导的基因组定向编辑技术，能够剔除外源DNA，是继转基因技术之后人类对生物进行遗传操作的又一个革命性技术。其中，第2类Ⅱ型的CRISPR/Cas9具有构建简单、编辑效率高、容易实现多基因编辑等优势，是应用最广泛的基因组编辑技术，自2013年首次成功实现人类细胞的基因组定向编辑以来，被迅速应用于人类、动物和植物等的基因组编辑，并产生多种衍生基因编辑系统(如单碱基编辑器)。以 CRISPR/Cas9为代表的基因组编辑技术已成为农作物重要基因功能研究、改造与品种遗传改良的重要工具和研究热点。虽然CRISPR/Cas9基因组编辑技术目前已在很多物种中得到广泛地应用，但是国内外文献查新显示，针对芦笋的基因编辑技术尚且未见报道。

CRISPR/Cas9系统需要表达具有双链断裂能力的Cas9蛋白和单导向RNA (singleguider RNA，sgRNA)，它们结合成Cas9/sgRNA复合体，由sgRNA 靶向目标基因的靶点序列，Cas9对靶点DNA进行切割产生双链断裂，并诱发 DNA修复时产生碱基变异，达到基因特异突变的目的(刘耀光等,华南农业大学学报,2019,40(5):1-12.)。因此，筛选合适的启动子来驱动sgRNA的转录对CRISPR/Cas9基因编辑体系发挥功能有至关重要的意义。