[发明专利]一种UPLC-MS/MS法检测微生物聚集体群感效应分子的方法

权利要求书

1. 一种UPLC-MS/MS法检测微生物聚集体群感效应分子的方法，其特征在于，该方法包括：

（1）样品前处理

收集的样品用双蒸水洗涤，然后用双蒸水定容到收集样品前的泥水混合体积；加入EDTA-4Na，使其终浓度为1~5mmol/L，然后进行超声处理；超声处理的条件包括：超声功率500~800W，工作4~6秒，间歇4~6秒，工作时间10~15min；超声时体系温度稳定控制在80℃~100℃；9000rpm离心5min，上清用0.22μm的微孔滤膜过滤，滤液用等体积的乙酸乙酯萃取3次，收集有机相，用氮吹仪吹干，然后加500μL甲醇溶解，保存待测；

所述样品为颗粒污泥或生物膜；

（2）UPLC-MS/MS检测

将步骤（1）处理后的样品加入UPLC-MS/MS中，梯度洗脱；所用的色谱柱为C18柱；

色谱条件包括：进样量10~20μL；流速0.1~0.3mL/min；分析时间8~12min；最大柱压580~620bar；柱温32~38℃；

洗脱条件包括：用A相液体和B相液体进行洗脱，所述的A相液体为含有4~6mmoI/L乙酸铵和0.08~0.12%，V/V甲酸的乙腈溶液；所述的B相液体为含有4~6mmoI/L乙酸铵和0.08~0.12%，V/V甲酸的水溶液；

梯度洗脱参数：0 min，A相达到设定的比例50%；0～3.0 min，两种流动相均速变化使A相在40%～60%；3.0～6.0min，A相为60%～80%；6.0～10 min，A相为80%～100%；10.0～12.0min，A相为100%～50%；比例均为体积百分比；

质谱条件：采用ESI+，MRM模式检测；

（3）微生物聚集体群感效应分子的检测

根据步骤（2）UPLC-MS/MS的检测结果，对样品中群感效应分子3-O-C6-HSL、3-O-C8-HSL、3-O-C10-HSL、3-O-C12-HSL、C6-HSL、C8-HSL、C10-HSL、C12-HSL进行定性和/或定量判断。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，该方法还包括建立所述群感效应分子的标准曲线，根据标准曲线对样品中群感效应分子进行定性和/或定量判断。

3.根据权利要求2所述的方法，其中，用于建立标准曲线的群感效应分子标准品的浓度分别为1000μg/L、500μg/L、100μg/L、50μg/L、10μg/L、1μg/L。

4.根据权利要求2所述的方法，其中，针对所述群感效应分子的标准曲线方程分别为：

3-O-C6-HSL：y = 190.95x + 1754.2，R² = 0.9988

3-O-C8-HSL：y = 571.78x + 8066.6，R² = 0.9965

3-O-C10-HSL：y = 63.049x - 649.78，R² = 0.9992

3-O-C12-HSL：y = 40.461x - 79.201，R² = 0.9992

C6-HSL：y = 271.51x + 5984.8，R² = 0.9958

C8-HSL：y = 142.53x + 560.53，R² = 0.9991

C10-HSL：y = 111.39x + 525.96，R² = 0.9986

C12-HSL：y = 59.515x + 448.85，R² = 0.9965。

5.根据权利要求2所述的方法，其中，所述群感效应分子的保留时间分别为：

3-O-C6-HSL：保留时间0.621min；

3-O-C8-HSL：保留时间1.455min；

3-O-C10-HSL：保留时间4.744min；

3-O-C12-HSL：保留时间5.737min；

C6-HSL：保留时间1.006min；

C8-HSL：保留时间4.293min；

C10-HSL：保留时间5.603min；

C12-HSL：保留时间6.443min。