[发明专利]一种特异性识别利巴韦林的适配体序列及其应用

说明书

本发明公开了一种特异性识别利巴韦林的适配体序列及其应用，属于食品安全生物技术领域。本发明以利巴韦林为靶标，利用Capture‑SELEX技术通过多轮筛选过程富集适配体，应用实时荧光定量PCR监测筛选过程，通过高通量测序直观全面地得到适配体库的所有序列信息，从而筛选得到富集程度最高的适配体序列；用比色法和荧光法两种方法表征了所得核酸序列的亲和性和特异性，得到亲和力和特异性良好的适配体序列。可用于检测蓄禽养殖动物体内、蓄禽养殖动物所用的食品和药品、人体血液中利巴韦林的含量。

技术领域

本发明涉及一种特异性识别利巴韦林的适配体序列及其应用，属于食品安全生物技术领域。

背景技术

利巴韦林是一种广谱类抗病毒药物，不仅可以抑制RNA病毒的复制，对DNA病毒也具有较强的抑制作用，常用于呼吸道疾病等的治疗。但是作为兽药用于动物的病毒性疫病治疗存在很大的安全风险，被禁止作为兽药的销售和使用。

抗病毒药物的滥用不仅会造成养殖动物品质和风味的下降，同时会导致药物残留和耐药性。利巴韦林在蓄禽养殖过程中的滥用会引发丙型肝炎病毒的耐药性，我国约有0.4亿的HCV携带者，平均感染率约为3.2％。70％以上的感染者会发展为肝炎和肝硬化，甚至肝癌。针对慢性HCV感染普遍采用长效干扰素联合利巴韦林的标准治疗方式，但这种方式失败率逐年升高，主要原因就是利巴韦林的耐药性。另外，利巴韦林还会抑制谷胱甘肽，损伤红细胞膜从而引发贫血，甚至会恶化已经存在的心脏疾病。因此，加强对于利巴韦林药物的认识，对其进行深入研究，开发出一种快速的检测方法迫在眉睫。

关于利巴韦林的检测主要集中在血浆中利巴韦林的检测和动物类食品和兽药中利巴韦林的检测，检测方法主要集中在色谱法和免疫法这两种方法中。其中，色谱法主要是以高效液相色谱和质谱的联用为主，通常需要专业的操作和昂贵的仪器。另外一种是基于抗原抗体相互作用的免疫法，主要有放射免疫法和酶联免疫法，但制备特异性抗体的过程繁琐费时，且制备得到的抗体稳定性差。

适配体筛选技术是利用指数富集的系统进化技术(SELEX)从体外合成的随机核苷酸序列中筛选获得能够特异性识别结合靶标的一段单链核苷酸序列。适配体能够以发夹、茎环、四联体等结构为基础折叠形成复杂的三维构象从而与靶标特异性结合，同时，适配体与靶标之间的范德华力、氢键、疏水作用等分子间作用力也大大增加了与靶标的结合能力。Capture-SELEX是将ssDNA文库通过其互补链间接固定在特定的载体上，靶标存在时，与靶标特异性结合的适配体发生三维空间结构的变化与其互补链解离脱落并形成适配体-靶标复合物进入溶液中。通过分离收集溶液即可获得与靶标特异性结合的适配体。适配体筛选技术相比于传统的检测方法(色谱法和免疫法)具有筛选周期短，亲和性高，特异性好，易于修饰，性能稳定且易于保存等优点。

发明内容

[技术问题]

现有的检测利巴韦林的色谱法存在设备昂贵、操作繁琐的问题，而免疫法存在周期长、亲和性低、特异性不强，抗体不稳定难以保藏的问题。

[技术方案]

本发明提供用于特异性识别利巴韦林的适配体，如下a)或b)所示：

a)SEQ ID NO:1～SEQ ID NO：7任一所示的核苷酸序列，

b)在a)限定的核苷酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个碱基且具有特异性识别利巴韦林能力的由a)衍生的核苷酸序列。

在本发明的一种实施方式中，用于特异性识别利巴韦林的适配体优选SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。

所述适配体的5′端或3′端还可以进行FITC、氨基、生物素或地高辛化学修饰。

本发明还提供一种筛选特异性识别利巴韦林的适配体的方法，主要包括以下步骤：