[发明专利]一种Aspergillus tubingensis绝对定量的探针及其应用

说明书

本发明公开了一种Aspergillus tubingensis绝对定量的探针及其应用，属于生物领域、发酵领域、检测领域。本发明的Aspergillus tubingensis定量探针和试剂盒，能够实现Aspergillustubingensis的总量检测，用于检测和Aspergillus tubingensis定量时不需要使用昂贵仪器，可在2.5h内快速完成定量工作。同时，本发明所使用的样品不必须进行核酸提取。基于本发明的探针、检测试剂盒用于Aspergillus tubingensis定量，具有快速、方便、便宜、准确的特点。

技术领域

本发明涉及一种Aspergillus tubingensis绝对定量的探针及其应用，属于生物领域、发酵领域、检测领域。

背景技术

Aspergillus tubingensis广泛存在于传统发酵食品中，参与发酵过程中的生物反应过程包括白酒、普洱茶等。例如在白酒发酵过程中，Aspergillus tubingensis可以代谢产生酸类化合物抑制杂菌生长，同时分泌多种酶类且具有较强的抗逆性。因此实时有必要跟踪Aspergillus tubingensis的生物量，对判断发酵批次稳定性以及发酵参数调控具有重要的指导意义。但目前传统发酵食品体系多多数是多菌种共发酵体系，通过简单的OD比色法无法判断样本中Aspergillus tubingensis的含量，虽然荧光定量PCR法结合特异性引物或探针可以实现混菌系统中Aspergillus tubingensis的定量，但是需要高额的设备和高要求的操作环境。因此，为方便、快速、准确地跟踪样本中Aspergillus tubingensis的生长变化趋势，有必要开发相应的Aspergillus tubingensis定量方法以及试剂盒。

G四链体/血红素模拟酶活检测的原理在于G四链体可以与血红素形成具有过氧化氢酶活性的DNA模拟酶，可催化过氧化氢氧化ABTS生成ABTS+，呈现绿色的显色反应，可在波长420nm下检测特征吸光值。G四链体结构的稳定性对整个检测过程至关重要，如果设计不当，当G四链体序列与其他碱基形成二聚体时，会导致G四链体序列无法形成G四链体，以此原理为基础的定量方法在使用中会导致低估样本中目标基因的含量，降低检测方法的灵敏度和准确性。

目前，基于G四链体/血红素模拟酶活检测的原理有被用于微生物的特异性检测的报道；例如文献WangY,Li X,Xi D,Wang X.Visual detection ofFusariumproliferatumbased on asymmetric recombinase polymerase amplificationandhemin/G-quadruplex DNAzyme.Rsc Advances 2019；9:37144-37147.中，使用了不对称特异性引物(上游引物添加G四链体的反向序列修饰，下游不修饰)，该方法只能适用于样本中特定细菌Fusariumproliferatum的检测，无法实现Aspergillus tubingensis的总量检测；此外，该文献利用该不对称特异性引物进行检测时，是在PCR体系中添加不同浓度的上下游引物(上游引物浓度低，下游引物浓度高)，通过重组聚合酶扩增(RPA)扩增形成双链产物，随着PCR反应的进行，上游引物被消耗殆尽，下游引物使用新合成的双链DNA为模板扩增，从而形成带有G四链体末端的单链DNA，从而使用G四链体/血红素模拟酶活检测检测样本中的Fusariumproliferatum。但该定量方法依然需要PCR步骤产生G四链体，而PCR过程依然需要高额PCR设备以及严格的操作环境。

发明内容

本发明的一种用于Aspergillus tubingensis绝对定量的探针、试剂盒及应用，解决了如下的至少一个技术问题：(1)现有的方法无法实现所有Aspergillus tubingensis的总量检测；(2)现有定量方法在物种分辨率较低和/或检测准确性不足；(3)现有定量方法需要高额的仪器设备和/或严格的操作环境，不适用于生产采样后的及时检测；(4)现有定量方法操作繁琐等。