[发明专利]重组糖蛋白及其用途

权利要求书

1.重组人α-半乳糖苷酶-A(rhAGA)蛋白，其具有一种或两种下列结构特征：

约0.1％至约1.5％的百分比的总N-连接寡糖为单唾液酸化寡糖；且

大于约9％的百分比的总N-连接寡糖为双-甘露糖-6-磷酸寡糖。

2.表达载体，其包含：

编码重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白的序列；

与编码人α-半乳糖苷酶-A蛋白的序列的5’末端可操作连接的启动子序列；

与编码人α-半乳糖苷酶-A蛋白的序列的5’末端可操作连接的具有TTG起始密码子的编码人CD52蛋白的肽的序列；和

与编码人α-半乳糖苷酶-A蛋白的序列的3’末端可操作连接的编码多聚(A)识别位点的序列。

3.生成对于糖蛋白重组表达有用的哺乳动物细胞系的方法，所述方法包括：

(a)提供血清依赖性永生化哺乳动物细胞系；

(b)在下列中顺序培养所述哺乳动物细胞系：

(1)在包含第一浓度(1X)的动物血清的细胞培养基中约5天至约10天；

(2)在包含约0.2X至约0.3X浓度的动物血清的细胞培养基中约5天至约10天；且

(3)在包含约0.01X至约0.08X的动物血清的细胞培养基中约5天至约10天；

(c)从(b)之后的培养物生成单细胞亚克隆培养物；

(d)选择具有可接受的转染效率的(c)的亚克隆，在无血清培养基中使细胞生长，并表达重组蛋白；

(d)在无蛋白、无血清、化学限定的培养基中培养(d)中选择的亚克隆约5天至约10天；

(e)从(d)之后的培养物生成单细胞亚克隆培养物；和

(f)选择具有可接受的转染效率、峰细胞密度、生长特性、体积生产率(VPR)和糖蛋白糖基化概貌的(e)的亚克隆，

其中(f)中选择的亚克隆对于糖蛋白的重组表达是有用的。

4.哺乳动物细胞，其对于由权利要求3的方法产生的糖蛋白的重组表达是有用的。

5.产生重组糖蛋白的方法，其包括：

提供权利要求4的哺乳动物细胞；

将包含编码糖蛋白的序列的表达载体引入所述细胞；

在无血清生长培养基中在足以产生所述糖蛋白的条件下培养所述细胞；和

从所述细胞或生长培养基收获所述糖蛋白。

6.由权利要求5的方法产生的重组糖蛋白，其中所述重组糖蛋白是重组人α-糖蛋白-A蛋白。

7.在受试者中治疗法布里病(Fabry disease)的方法，所述方法包括对具有法布里病的受试者施用治疗上有效量的权利要求1或6的rhAGA蛋白。

8.在哺乳动物细胞内的溶酶体中增加α-半乳糖苷酶-A蛋白水平的方法，所述方法包括将哺乳动物细胞与有效量的权利要求1或6的rhAGA接触。

9.减少受试者血清中球形三酰神经酰胺(globotriaosylceramide)水平的方法，所述方法包括对有需要的受试者施用治疗上有效量的权利要求1或6的rhAGA蛋白。

10.生成对于糖蛋白重组表达有用的哺乳动物细胞系的方法，所述方法包括：

(a)提供血清依赖性永生化哺乳动物细胞系；

(b)在下列中顺序培养哺乳动物细胞系：

(1)在包含第一浓度(1X)的动物血清的细胞培养基中约1天至约10天；

(2)在包含约0.2X至约0.6X浓度的动物血清的细胞培养基中约1天至约10天；和

(3)在包含0X至约0.10X动物血清的细胞培养基中约5天至约10天；

(c)从(b)之后的培养物生成单细胞亚克隆培养物；

(d)选择具有可接受的转染效率的(c)的亚克隆，在无血清培养基中使细胞生长，并表达重组蛋白；

(e)从(d)中选择的亚克隆生成单细胞亚克隆培养物；且

(f)选择具有可接受的转染效率、峰细胞密度、生长特性、体积生产率(VPR)和重组蛋白表达的(e)的亚克隆，

其中(f)中选择的亚克隆对于糖蛋白的重组表达是有用的。