[发明专利]一种间充质干细胞体外抑制Th1、Th17的检测方法

说明书

本发明涉及干细胞生物学技术领域，更具体涉及一种间充质干细胞体外抑制Th1、Th17的检测方法。包括：步骤一：间充质干细胞和外周血单个核细胞共培养；步骤二：固定破膜染色和检测。本发明提供一种检测方法，通过使用间充质干细胞和外周单个核细胞共培养，促进淋巴细胞增殖分化，从而促进间充质干细胞抑制作用的体现，提高抑制效果；对共培养得到的PBMC细胞进行刺激阻断，从而促进因子分泌，同时加入抑制及将因子阻断，来进行检测，从而进一步促进PBMC细胞中Th1和Th17的表达，提高检测得到的Th1和Th17的表达，提高进一步体现抑制效果。

技术领域

本发明涉及干细胞生物学技术领域，更具体地，本发明涉及一种间充质干细胞体外抑制Th1、Th17的检测方法。

背景技术

间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一类多能干细胞，来源于发育早期的中胚层和外胚层，可以在骨髓、脂肪、滑膜、骨骼、肌肉和脐带等多种组织中分离，具有向成骨细胞、成软骨细胞、成脂肪细胞、骨髓基质、神经细胞、肝脏细胞、胰岛细胞和心肌细胞等多向分化的潜能。具有来源方便，易于分离、培养、扩增和纯化，多次传代扩增后仍具有干细胞特性，不存在免疫排斥的特性。

间充质干细胞不仅能促进损伤组织的再生与修复，还拥有良好的免疫调节能力，此外还可以作为基因治疗的载体。制备间充质干细胞的方法种类繁多，例如组织块贴壁培养法、脐带匀浆胶原酶消化法与改良胶原酶消化法等，但是目前的研究大多着眼于间充质干细胞的临床治疗应用，并不存在一个良好的评价机制来鉴定诸多制备方法制备得到的间充质干细胞免疫调节能力的好坏。

CN201811507077.2提供间充质干细胞免疫调节能力的检测方法，将原始样本与待评价的间充质干细胞进行共培养，通过检测淋巴细胞亚群的比例变化量，来评价间充质干细胞的抑制作用，从而对间充质干细胞的免疫调节能力进行评价，但是在间充质干细胞体外抑制T淋巴细胞亚群Th1和Th17检测中，存在抑制率低、效果不明显、重复性差等特点。

发明内容

为了解决上述问题，本发明第一个方面提供了一种间充质干细胞体外抑制Th1、Th17的检测方法，包括：

步骤一：间充质干细胞和外周血单个核细胞共培养；

步骤二：固定破膜染色和检测。

作为本发明一种优选的技术方案，所述步骤一包括：将间充干细胞和外周血单个核细胞混合，加入抗体培养后，离心，加入含有刺激剂的培养基刺激细胞后，加入抑制剂培养、离心，得到的细胞沉淀洗涤后，用平衡盐溶液重悬，得到重悬溶液。

作为本发明一种优选的技术方案，所述步骤一中，间充质干细胞和外周血单个核细胞的细胞数比为1：(5～15)。

作为本发明一种优选的技术方案，所述抗体包括anti-CD3和anti-CD28。

作为本发明一种优选的技术方案，所述anti-CD3的浓度为3～7μg/mL，所述anti-CD28的浓度为3～7μg/mL。

作为本发明一种优选的技术方案，所述刺激剂包括PMA和Ionomycin。

作为本发明一种优选的技术方案，所述含有刺激剂的培养基中，PMA的浓度为40～60ng/mL，Ionomycin的浓度为0.8～1.5μg/mL。

作为本发明一种优选的技术方案，所述步骤二包括：将步骤一得到的重悬溶液中细胞用固定剂、破膜剂和染色抗体处理后，孵育、洗涤，去除上清液后，加入重悬溶液检测。

作为本发明一种优选的技术方案，所述步骤二包括：

将步骤一得到的重悬溶液细胞依次用固定剂、破膜剂和染色抗体处理后，孵育、洗涤，去除上清液后，加入重悬溶液检测。

本发明第二个方面提供了一种所述的