[发明专利]氟氯氰菊酯半抗原、人工抗原和抗体及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了氟氯氰菊酯半抗原、人工抗原和抗体及其制备方法和应用，本发明提供的氟氯氰菊酯半抗原既最大程度保留了氟氯氰菊酯的特征结构，使得氟氯氰菊酯半抗原的免疫原性明显增强，又具有可以与载体蛋白发生偶联的羧基；用氟氯氰菊酯半抗原与载体蛋白偶联后得到的氟氯氰菊酯人工抗原去免疫动物，更有利于刺激动物免疫应答产生特异性更强、灵敏度更高的抗体，经检测氟氯氰菊酯抗体的灵敏度可达0.1μg/L，与其他菊酯类杀虫剂的交叉反应率低，为后续建立氟氯氰菊酯的各种免疫分析方法提供了基础。

技术领域

本发明属于食品安全检测领域。更具体地，本发明涉及氟氯氰菊酯半抗原、人工抗原和抗体及其制备方法和应用。

背景技术

氟氯氰菊酯(Cyfluthrin)是一种杀虫活性较高的拟除虫菊酯类杀虫剂，其对害虫的作用方式以触杀、胃毒作用为主，对多种鳞翅目害虫和某些地下害虫有良好的防效，被广泛应用于果蔬、茶叶和烟草中。但由于长期过量使用，其污染、残留所造成的环境问题已受到广泛关注。我国国家标准GB 2763规定了蔬菜及部分水果中氟氯氰菊酯的最大残留限量，因此建立相应农产品中氟氯氰菊酯的检测方法势在必行。

目前，国内外检测氟氯氰菊酯主要采用气相色谱法、气相色谱-质谱法和液相色谱串联质谱法等分析方法，存在样品前处理繁琐、检测时间长、仪器贵重等缺点，所以在我国无法得到广泛应用，并且不符合现场检测“在短时间内低成本对大量样品进行准确检测和筛选”的要求。而免疫学检测分析技术以其高灵敏、特异性高、快速、操作简便等优点在药物残留检测领域已被广泛应用，比起仪器等检验方法有很多优势。所以免疫分析为氟氯氰菊酯残留研究提供了一条新的分析检测方法。

在建立免疫学检测方法并应用该检测方法检测氟氯氰菊酯残留量时，关键技术在于能够获取到特异性强、灵敏度高的抗体，而要实现这一目标，前提条件就是得合成、制备出合适的氟氯氰菊酯半抗原。

发明内容

针对现有技术中存在的不足之处，本发明提供一种能最大程度保留氟氯氰菊酯的特征结构，又具有一定长度连接臂的半抗原以及这种半抗原的制备方法；以此半抗原制备的人工抗原、检测灵敏度高和特异性强的抗体；以及此半抗原的应用。

为了实现本发明的目的，第一方面，本发明提供一种氟氯氰菊酯半抗原，其具有如下结构式：

本发明提供的氟氯氰菊酯半抗原在氟氯氰菊酯的分子结构上引入羧基活性基团，从而可以与载体蛋白进行偶联得到人工抗原用于免疫；该氟氯氰菊酯半抗原保留了氟氯氰菊酯的所有特征基团，最小改变氟氯氰菊酯原有结构特征，同时与载体蛋白偶联后，突出的是氟氯氰菊酯本身独有的结构，为后续刺激动物免疫应答产生特异性更强、灵敏度更高的抗体奠定基础。

第二方面，本发明提供上述氟氯氰菊酯半抗原的制备方法，其包括如下步骤：

1)使羟基二氯菊酸与二氯亚砜反应形成酰氯，再与(alpha S)-4-氟-alpha-羟基-3-苯氧基-苯乙腈进行缩合反应，得到中间体1，所述中间体1具有结构式优选地，将羟基二氯菊酸溶解在吡啶中，加入二氯亚砜，室温搅拌反应2h后蒸干，再加入二氯甲烷溶解，加(alpha S)-4-氟-alpha-羟基-3-苯氧基-苯乙腈和三乙胺，室温搅拌反应3h，停止反应；优选地，羟基二氯菊酸、二氯亚砜、(alpha S)-4-氟-alpha-羟基-3-苯氧基-苯乙腈的摩尔比为1:1:1；

2)使中间体1与琥珀酸酐发生酯化反应，得到氟氯氰菊酯半抗原；优选地，中间体1、琥珀酸酐的摩尔比为1:1。

本发明根据氟氯氰菊酯的结构特点，通过全合成的方式，即羟基二氯菊酸与二氯亚砜形成酰氯，再与(alphaS)-4-氟-alpha-羟基-3-苯氧基-苯乙腈进行缩合成酯，使得在氟氯氰菊酯的三元环上引入羟基，进而再与琥珀酸酐进行酯化反应，从而在三元环上引入羧基间隔臂，使用的原料易得，反应操作较为简单，反应条件易于控制，制备的氟氯氰菊酯半抗原的纯度和收率较高。