[发明专利]一种高效去除血流感染样本中宿主核酸的方法

说明书

本发明公开了一种高效去除血流感染样本中宿主核酸的方法，可以提高病原检出率。本发明提供了一种去除血流感染样本中宿主核酸的方法，其特征在于：将血流感染样本依次进行如下步骤：(1)加入皂苷以进行裂解，然后收集沉淀；(2)采用NaCl浓度为0.5M以上的NaCl溶液洗涤；(3)加入叠氮溴化丙锭并进行光解，然后收集沉淀；(4)采用NaCl浓度为0.5M以上的NaCl溶液洗涤。所述方法可以有效去除宿主核酸，从而可以更有效的检测样本中的病原微生物。本发明对于血流感染的鉴定具有重要的应用价值。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种高效去除血流感染样本中宿主核酸的方法，可以提高病原检出率。

背景技术

将败血症和菌血症统称为血流感染(bloodstreaminfection)。败血症(septicemia)是由各种病原微生物(细菌或真菌)和毒素侵入血流所引起的血液感染，主要临床表现为：骤发寒战，高热，心动过速，呼吸急促，皮疹，肝脾肿大和精神，神志改变等一系列严重临床症状，严重者可引起休克，弥散性血管内凝血(DIC)和多脏器功能衰竭。若细菌仅短暂入血，而无临床明显的毒血症状(如血管相关性感染)则称为菌血症(bacteremia)。

血流感染(BSI)在全世界范围内都有高死亡率和多重耐药性，所以快速精准的抗生素治疗对抑制病情发展和耐药菌株产生就显得尤为重要。临床上对于病原菌的检测金标准依然是分离培养法，这种传统诊断法耗时长，敏感性差，无法快速有效用药。随着分子诊断技术的发展，测序技术逐渐应用于临床诊断。序列比对是测序结果转化的一个必要过程，而庞大的测序数据也是多年来困扰研究人员的一个热点。由于测序产出的数据会包含大量宿主序列而很少含有微生物序列，微生物序列数占比太小，这会严重影响测序的敏感度和后续的比对效率。对于细胞含量巨大的全血样本更是如此。

现有的宿主核酸去除方法有酶解法，超声破碎法，过滤去除法，试剂盒法等等效果都不显著。

叠氮溴化丙锭(PMA)是biotium公司开发的一种具有高亲和力的光敏DNA嵌合染料。染料本身具有弱荧光，但是和核酸结合之后荧光性变强。它具有高亲和力并优先结合到双链DNA上。由于光解作用，染料上光敏的叠氮基转化为高反应性的氮烯基，其易于与结合部位的任何烃(碳氢化合物)部分反应，形成稳定的共价键的氮-碳键，从而导致永久性的DNA修饰。染料几乎完全细胞膜不透性，从而可以用于选择性的结合死细胞中暴露的DNA。目前，对PMA的报道主要是用来做细菌的活性研究，还没有利用PMA进行宿主核酸去除的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种高效去除血流感染样本中宿主核酸的方法，可以提高病原检出率。

本发明提供了一种对血流感染样本进行前处理的方法，其特征在于：

将血流感染样本依次进行如下步骤：

(1)加入皂苷以进行裂解，然后收集沉淀；

(2)采用NaCl浓度为0.5M以上的NaCl溶液洗涤；

(3)加入叠氮溴化丙锭并进行光解，然后收集沉淀；

(4)采用NaCl浓度为0.5M以上的NaCl溶液洗涤。

进行所述前处理后，血流感染样本中的宿主DNA的绝对丰度降低，病原微生物DNA的绝对丰度不变(相对丰度增高)，从而可以更有效的检测血流感染样本中的病原微生物。

本发明还提供了一种提取并富集血流感染样本中的病原微生物DNA的方法，其特征在于：

将血流感染样本依次进行如下步骤：

(1)加入皂苷以进行裂解，然后收集沉淀；

(2)采用NaCl浓度为0.5M以上的NaCl溶液洗涤；

(3)加入叠氮溴化丙锭并进行光解，然后收集沉淀；