[发明专利]适用于盐胁迫条件下雪茄烟基因表达分析的内参基因及其应用

说明书

本发明涉及适用于盐胁迫条件下雪茄烟基因表达分析的内参基因及其应用。本发明通过geNorm、NormFinder和BestKeeper三个分析软件对RPL8、RPL14A、RPS16、UBC27、UBC28、UBC35、AC10、EIF2、PSAP和CPI十个候选内参基因在雪茄烟盐胁迫条件下的表达稳定性进行了分析。结果表明UBC28基因在雪茄烟不同条件盐处理组织中稳定表达，即UBC28基因能够作为qRT‑PCR的内参基因。本发明进一步提供了UBC28基因的qRT‑PCR引物，为雪茄烟盐胁迫条件下基因表达的精确定量分析奠定了基础。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及适用于盐胁迫条件下雪茄烟基因表达分析的内参基因及其应用。

背景技术

雪茄烟(Nicotiana tabacum L)是全部由烟叶卷制成的圆或方形的吸用烟卷，是一类特殊烟草制品。目前，世界上优质雪茄烟叶主要产于古巴、美国、厄瓜多尔、印尼等国。我国生产的雪茄茄衣质量远远达不到优质水平，因此，国内优质茄衣原料的匮乏，严重制约了我国雪茄产业的快速发展。良好品种的缺乏和现有品种的退化成为茄衣烟叶的主要问题。随着分子生物学、遗传学的快速发展，从茄衣基因的角度研究并改良现有品种成为可能。我国雪茄烟叶最具潜在优势的地区在海南，经过多年的发展，海南雪茄烟叶的种植已初步形成规模，但烟叶质量有待提高，其中一个重要因素是海南雪茄烟叶氯离子含量总体偏高，且通过优化田间管理等措施并未从根本上改变雪茄烟叶的质量问题，因此亟需从基因角度定向改良以期获得目标形状。

在分析雪茄烟叶在盐处理条件下基因表达过程中需要使用内参基因。由于雪茄基因组尚未完成测序，随着转录组测序技术的发展，大量的转录组数据为挖掘雪茄烟新的内参基因提供了良好的数据基础和平台，也为内参基因的选择提供了更为广阔的空间。在实时荧光定量PCR(qRT-PCR)中，对目标基因相对表达量的分析主要通过内参基因的均一化来确定，因此，选择合适的内参基因非常关键。理想的内参基因应该是在不同发育阶段和不同组织器官中稳定表达，且表达量不受其他外界因素、实验条件的影响。

一般来说，由于看家基因广泛参与有机体的基本生化反应，因此常作为内参基因来使用。目前常用的内参基因有肌动蛋白家族(ACTIN)、核糖体蛋白基因(Ribosomalprotein L,RPL)、转录延伸因子基因(Elongation factors 1alpha,EF-1α)、多聚泛素酶基因(ubiquitin,UBQ)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase,GAPDH)、β微管蛋白基因(tubulin,TUB)等。但是，这些广泛应用的内参基因在不同植物品种及不同实验条件下的表达并不稳定；迄今为止，关于雪茄烟盐处理条件下的内参基因筛选几乎没有报道。

发明内容

本发明的目的是提供适用于盐胁迫条件下雪茄烟基因表达分析的内参基因，所述内参基因为UBC28基因，在不同盐胁迫条件下雪茄烟中具有良好的表达稳定性，为准确定量分析雪茄烟盐胁迫条件下功能基因转录表达水平奠定基础。

本发明的第二个目的在于提供上述UBC28基因作为内参基因在qRT-PCR检测盐胁迫条件下雪茄烟基因转录表达水平中的应用。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一方面，本发明提供了适用于盐胁迫条件下雪茄烟基因表达分析的内参基因，所述内参基因为UBC28基因，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示。

进一步的，所述UBC28基因的扩增引物为：

F：ATGGCTTCGAAACGAATAT

R：TCATCCCTTTCCATATGAAAC

另一方面，本发明提供了UBC28基因作为内参基因在qRT-PCR检测盐胁迫条件下雪茄烟基因转录表达水平中的应用。

UBC28基因的特异性引物为：